pET系统表达原理 诱导的情况下 ECO基因组 lacUV5 T7 RNA Polymerase gene 目标基因 2阻遏蛋白 pET 乳糖或PTG T7启动子 TG:异丙基βD-硫代吡喃半乳糖苷,乳糖结构类似物,是一种作用极强的诱导剂,不被 细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。价格昂贵,工业生产不用 Jilin University
Jilin University pET系统表达原理 lacUV5 T7 RNA Polymerase gene E.Coli 基因组 lacI 阻遏蛋白 诱导的情况下 pET 目标基因 T7 启动子 乳糖或IPTG IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，乳糖结构类似物，是一 种作用极强的诱导剂，不被 细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。价格昂贵，工业生产不用
4、原核表达的包涵体间题 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形 成无活性的固体颗粒 包涵体的成分由50%以上的重组蛋白,糖体元 件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA, 以及脂体、脂多糖等组成,大小为0.5-1um, 密度高(约13mg/m),无定形,呈非水溶性 ,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第12页
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第12页 4、原核表达的包涵体问题 ➢ 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形 成无活性的固体颗粒。 ➢ 包涵体的成分由50%以上的重组蛋白，糖体元 件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA， 以及脂体、脂多糖等组成，大小为0.5-1um， 密度高（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性 ，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等
) 包涵体形成主要原因 1、基因工程菌的表达产率过高,超过了细菌正常的代谢水平, 由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和,使之表达产物积累 起来。 2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包 涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关 3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电 点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译 后修饰所需酶类和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等,致使中间 体大量积累,容易形成包涵体沉淀。 5、蛋白质在合成之后,于中性pH或接近中性pH的环境下,其本 身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键,即是说,有的表达 产率很高,如 Aspartase和 Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%, 也不形成包涵体,而以可溶形式出现 6、在细菌分泌的某个阶段,蛋白质分子间的离子键、疏水键或 共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第13
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第13页 包涵体形成主要原因 ➢ 1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平， 由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累 起来。 ➢ 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包 涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 ➢ 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电 点时容易形成包涵体。 ➢ 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译 后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 ➢ 5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本 身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达 产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%, 也不形成包涵体，而以可溶形式出现。 ➢ 6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或 共价键等化学作用导致了包涵体的形成
) 5、亲和层析原理 Column with substance S covalently bonded to supporting material Add higl Sample P1 molecules(△) concentration containing bind to s of S to eluent mixture of proteins Rest of proteins (Pe, P3,)(00)eluted Substance s P20 P, is eluted from column 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第14
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第14页 5、亲和层析原理
理想的亲和层析检测结果 KDa M 2 3 4 5 1160 M: protein marker 1:未诱导 45.0 2:诱导表达 3:挂柱穿透组分 35.0 4:洗涤组分 5:洗脱组分 250 a-histag 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第15頁
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第15页 理想的亲和层析检测结果 M：protein marker 1：未诱导 2：诱导表达 3：挂柱穿透组分 4：洗涤组分 5：洗脱组分