) Western Blot操作关键步骤 多 1.组织采集或细胞培养 2.样品制备 3. SDS-PAGE 4.转膜 5.一抗的孵育 6.二抗的孵育 7.显影 中国免疫学实验网 www.immuexp.com 吉林大学国家
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第6页 ➢ 了解工程菌发酵及外源蛋白表达的特点和方法； ➢ 掌握镍柱亲和层析的基本原理和操作方法； ➢ 掌握蛋白质印迹技术（Western Blot）的基本原 理和操作方法
) 实验原理 1、菌株构建与目的蛋白 >目的蛋白:Ⅱ-18含有157个氨基酸残基,分子量为 18.3KkDa(???),p=49 菌株构建:分子生物学实验《重组人白介素-18(rhlL 18)基因工程菌的构建》 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第7頁
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第7页 二、实验原理 1、菌株构建与目的蛋白 ➢ 目的蛋白：IL-18含有157 个氨基酸残基，分子量为 18.3kDa（？？？），pI=4.9。 ➢ 菌株构建：分子生物学实验《重组人白介素-18(rhIL- 18)基因工程菌的构建》
) 2、技术路线 hIL18 pET32a 基因合成双酶切 双酶切 hL-18基因片段 线性pET32a 接 酶切 PCR 及测序鉴定 pET-hIL18 纯化 BL21中表达Tax-hL8 SDS-PAGE检测分子量 生物活性检测 Western blot定性鉴别 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第8页
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第8页 2、技术路线 hIL18 基因合成 双酶切 pET32a BL21中表达 pET-hIL18 纯化 双酶切 hIL-18基因片段 线性pET32a Tax-hIL18 连接 酶 切 、 P C R 及 测 序 鉴 定 SDS-PAGE检测分子量 生物活性检测 Western Blot定性鉴别
3、pET表达系统的原理
3、pET表达系统的原理
pET系统表达原理 未诱导的情况下 ECO∥基因组 lacUV5 T7 RNA Polymerase gene 目标基因 ac/阻遏蛋白 pET T7启动子 Jilin University
Jilin University pET系统表达原理 lacUV5 T7 RNA Polymerase gene E.Coli 基因组 pET 目标基因 T7 启动子 lacI 阻遏蛋白 未诱导的情况下