eHs:tg—历久弥新的6组氨酸标签 表9 His-tag被认为是蛋白纯化的首选标签的五个因素 「N端的Hs-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达: 采用固定化金属离子亲合层析纯化Hsg融合蛋白操作简便 His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,而不象GST标签那样容易形成二聚体,从而影响蛋白的 特性: His-Tag非常小,不会改变目的蛋白自身的可溶性,相反一些大的标签如MBP,可大大提高融合蛋白 的可溶性,尽管目的蛋白本身是不可溶或者折叠不正确: HsTg非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白结构没有影响 His-tag可与多种金属离子发生特殊的相 互作用,包括Ca2+、Mg2+、N2、Co2+ 等,其中以镍离子使用最为广泛。 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第161
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第16页 His-tag——历久弥新的6组氨酸标签 His-tag可与多种金属离子发生特殊的相 互作用，包括Ca2+ 、Mg2+ 、Ni2+ 、Co2+ 等，其中以镍离子使用最为广泛
) imidazole : His 固相载体 Ni!His His Protein C-COOH O-C-C-C-O-C-C-C-N elution OH OH C-COOH 吉林大学国家级生物实验教学乐心上7廴
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第17页 Ni 固相载体 His His His Protein imidazole -O-C-C-C-O-C-C-C-N elution OH C-COOH OH C-COOH Juang RH (2004) ECX
) 6、 SDS-PAGE原理 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用 蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移,迁 移的速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白 质的大小和形状 ≯使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的 负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的 电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的 电荷差别。 吉林大学国家级生物实验教学杀范中心第18页
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第18页 6、SDS-PAGE原理 ➢ PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 ➢ 蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，迁 移的速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白 质的大小和形状。 ➢ 使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的 负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的 电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的 电荷差别
) 7、 Western blot原理 Western免疫印迹( Western blot)是将蛋白 质转移到膜上后利用抗体进行检测的技术。 Detection in Western Blots Detection Signal oo(colorimetric or chemiluminescent Enzyme-conjugated o Enzyme Substrate Secondary Antibody Primary Antibody Target Protein Membrane Containing Transferred Protein 吉林大学国家
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第19页 7、Western Blot原理 ➢ Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白 质转移到膜上后利用抗体进行检测的技术
) Western blot流程 Western Blot 检测 收集蛋白样品 SDS-PAGE电永 抗>转膜 闭团 二抗 一抗二抗群向 ←显显色 吉林大学国家
吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第20页 Western Blot流程