基因工程学教案【本课小结】2.1DNA的分离、检测和纯化2.1.1基因组DNA的提取CTAB法和SDS法2.1.2非基因组DNA提取，质粒提取，碱裂解法2.1.3DNA的浓度和纯度测定2.2RNA的分离、纯化和检测2.1.1trizol法提取RNA2.1.2RNA质量检测【课后作业】思考题：碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理。CTAB法提取DNA的原理及注意事项；SDS法提取基因组DNA的原理及注意事项：Trizol法提取RNA的原理及注意事项：检测核酸质量的方法有几种？根据的原理是什么？教学反思学生在学习这部分知识的时候，要适当带大家进行知识回顾，因为在上学期的时候刚刚上过生物技术大实验，所以应该有这部分印象，然后将这部分的理论知识进行详细的讲解，让大家也更好的了解了实验操作的原理。另外这部分知识是后面基因分离的基础，不是孤立的。要引导学生进行思考。-16 -
基因工程学教案 - 16 - 【本课小结】 2.1 DNA 的分离、检测和纯化 2.1.1 基因组 DNA 的提取 CTAB 法和 SDS 法 2.1.2 非基因组 DNA 提取，质粒提取，碱裂解法 2.1.3 DNA 的浓度和纯度测定 2.2 RNA 的分离、纯化和检测 2.1.1 trizol 法提取 RNA 2.1.2 RNA 质量检测 【课后作业】 思考题：碱裂解法提取大肠杆菌质粒 DNA 的原理。 CTAB 法提取 DNA 的原理及注意事项； SDS 法提取基因组 DNA 的原理及注意事项； Trizol 法提取 RNA 的原理及注意事项； 检测核酸质量的方法有几种？根据的原理是什么？ 教学反思 学生在学习这部分知识的时候，要适当带大家进行知识回顾，因为在上学期的时候刚刚上 过生物技术大实验，所以应该有这部分印象，然后将这部分的理论知识进行详细的讲解， 让大家也更好的了解了实验操作的原理。另外这部分知识是后面基因分离的基础，不是孤 立的。要引导学生进行思考
基因工程学教案第三章目的基因的分离（6学时）知识目标：了解基因工程操作过程中的基本技术的应用。掌握PCR技术的理论知识。掌握基因文库构建方法，化学合成法等多种目的基因获得方法。教学目标技能与能力目标：掌握基因文库构建技术。掌握PCR反应操作；PCR引物的设计方法。情感态度价值观目标：培养严谨的工作作风。用发展的眼光看待问题。基因文库构建。掌握PCR反应操作；PCR引物的设计方法。教学重点化学合成法；蛋白质工程改造。基因文库的构建。教学难点PCR程序、体系等优化及引物设计。2 学时3.1基因文库构建学时分配3.2PCR技术2学时2学时3.3化学合成法、蛋白质工程改造法及Genbank法教学方法讨论法+讲授法教学手段传统教学+现代多媒体+视频基因组文库基因文库获取目的基因cDNA文库反应体系普通PCR反应程序PCR获取与扩增目目的基因的分离知识结构的基因其他PCR引物设计原则体系化学合成法GENBANK基因组数据库获取通过蛋白质工程改造目的基因-17-
基因工程学教案 - 17 - 第三章 目的基因的分离（6 学时） 教学目标 知识目标：了解基因工程操作过程中的基本技术的应用。掌握 PCR 技术的理论 知识。掌握基因文库构建方法，化学合成法等多种目的基因获得方法。 技能与能力目标：掌握基因文库构建技术。掌握 PCR 反应操作; PCR 引物的设 计方法。 情感态度价值观目标：培养严谨的工作作风。用发展的眼光看待问题。 教学重点 基因文库构建。掌握 PCR 反应操作; PCR 引物的设计方法。 化学合成法；蛋白质工程改造。 教学难点 基因文库的构建。 PCR 程序、体系等优化及引物设计。 学时分配 3.1 基因文库构建 2 学时 3.2 PCR 技术 2 学时 3.3 化学合成法、蛋白质工程改造法及 Genbank 法 2 学时 教学方法 讨论法+讲授法 教学手段 传统教学＋现代多媒体+视频 知识结构 体系 目的基因的分离 基因文库 获取目的基因 基因组文库 cDNA文库 PCR获取与扩增目 的基因 普通PCR 反应体系 反应程序 其他PCR 引物设计原则 化学合成法 GENBANK 基因组 数据库获取 通过蛋白质工程 改造目的基因
基因工程学教案授课题目3.1基因文库的构建授课序次5店总学时数2学时授课时长90分钟备注教学过程及授课内容【课堂导入】华大国家基因库、沈阳何氏眼科构建的眼基因库新闻入手，导入新课第三章第一节基因文库技术分离目的基因【探究新知】一、概念及其构建意义所谓文库(1ibrary)是指一种全体的集合。基因文库(genelibrary)则是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组重组后转化宿主细胞转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑）或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来一般需要先进行扩增所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。二、构建基因文库的流程基因文库构建包括以下基本程序①DNA提取及片段化或是cDNA的合成，②载体的选择及制备。③DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。③转化细胞的筛选。- 18 -
基因工程学教案 - 18 - 授课题目 3.1 基因文库的构建 授课序次 5 总学时数 2 学时 授课时长 90 分钟 教学过程及授课内容 备注 【课堂导入】 华大国家基因库、沈阳何氏眼科构建的眼基因库 新闻入手，导入新课 第三章 第一节基因文库技术分离目的基因 【探究新知】 一、 概念及其构建意义 所谓文库(1ibrary)是指一种全体的集合。 基因文库(gene library)则是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组 体形式出现。某生物 DNA 片段群体与载体分子重组 重组后转化宿主细胞 转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个 DNA 片段的克隆。全部 DNA 片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起 来 更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体 DNA 分 子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来 一般需要先进行扩增 所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离 都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。 二、 构建基因文库的流程 基因文库构建包括以下基本程序 ① DNA 提取及片段化 或是 cDNA 的合成。 ② 载体的选择及制备。 ③ DNA 片段或 cDNA 与载体连接。 ④ 重组体转化宿主细胞。 ⑤ 转化细胞的筛选
基因工程学教案当获得了含重组体的宿主细胞时即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分离基因的基础。基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把目的基因从文库中分离出来。分离出目的基因，还必须对其进行必要的检测与分析。如进行序列测定、体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆基因的分离、分离基因的鉴定是利用基因文库技术分离目的基因的主要内容。三、基因文库的类别根据基因类型：基因文库可分为基因组文库及cDNA文库。基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。四、基因文库与cDNA文库的优缺点比较基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA。它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期、某一特定组织(或器官)、在某种环境条件下的基因表达情况。并不能包括该生物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。再者，cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA因而无发育时期及组织器官特异性在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。目前这两类基因文库在基因工程中都得到有效应用。选择哪一种主要是根据实验目的。在分离RNA病毒基因、研究功能蛋白序列、分离特定发育阶段-19 -
基因工程学教案 - 19 - 当获得了含重组体的宿主细胞时 即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分离 基因的基础。基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把目的 基因从文库中分离出来。分离出目的基因，还必须对其进行必要的检测与分析。 如进行序列测定、体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基 因的结构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆 基因的分离、分离基因的鉴定是利用基因文库技术分离目的基因的主要内容。 三、 基因文库的类别 根据基因类型：基因文库可分为基因组文库及 cDNA 文库。 基因组文库是指将某生物的全部基因组 DNA 切割成一定长度的 DNA 片段克 隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA 文库是指某生物某一发育时期所转录的 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 基因组文库根据 DNA 来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒 体基因组文库。 四、 基因文库与 cDNA 文库的优缺点比较 基因组文库与 cDNA 文库的区别在于 cDNA 文库是有时效性的。文库构建 时的信息供体是某一时空条件下的细胞总 mRNA。它是在转录水平上反映该生 物在某一特定发育时期、某一特定组织(或器官)、在某种环境条件下的基因表达 情况。并不能包括该生物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因 组的功能信息。再者，cDNA 文库只反映 mRNA 的分子结构。cDNA 中不含有 真核基因的间隔序列及调控区，确切说 cDNA 并不是真正意义上的基因。 基因组文库构建时遗传信息供体是基因组 DNA 因而无发育时期及组织器官特 异性 在一个完全的基因组文库中包含着基因组 DNA 上的所有编码区及非编 码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基 因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信 息。 目前这两类基因文库在基因工程中都得到有效应用。选择哪一种 主要是 根据实验目的。在分离 RNA 病毒基因、研究功能蛋白序列、分离特定发育阶段
基因工程学教案或特定组织特异表达的基因时应构建cDNA文库。在研究mRNA分子中不存在的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。五、基因文库的载体常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体(P1人工染色体)BAC载体（细菌人工染色体）YAC载体(酵母人工染色体)。选用根据目标基因的大小载体宿主容量(kb)黏粒30-45大肠杆菌PI70-100大肠杆菌PAC130-150大肠杆菌大肠杆菌BAC120-300YAC250-400酵母六、基因文库的代表性其计算公式如下：N=ln(1-p)/In(1-f)N，基因文库所包含克隆的数目；P，任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%：f，克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小（bp)的分数。【讨论提问】现在我们要构建一个文库，如哺乳动物，其基因组大小为3x10%，插入片段为17kb，那么构建的基因组文库有多少个克隆？N=ln(1-p)/ln(1-f) =ln(1-0.99)/ln[1-(1.7x10*/3x10°j=8.1x105【本课小结】1.分离目的基因的几种常见方法-20-
基因工程学教案 - 20 - 或特定组织特异表达的基因时应构建 cDNA 文库。在研究 mRNA 分子中不存 在的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。 五、基因文库的载体 常用的基因组文库载体有 黏粒载体、 P1 噬菌体载体、 PAC 载体(P1 人工染色体)、 BAC 载体(细菌人工染色体) YAC 载体(酵母人工染色体)。 选用 根据目标基因的大小 载体 容量(kb) 宿主 导入细胞方式 黏粒 30-45 大肠杆菌 转导 P1 70-100 大肠杆菌 转导 PAC 130-150 大肠杆菌 电转 BAC 120-300 大肠杆菌 电转 YAC 250-400 酵母 转化 六、基因文库的代表性 其计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-f) N ， 基因文库所包含克隆的数目； p ， 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要 求大于 99%； f， 克隆的 DNA 片段大小（bp）占基因组大小 (bp)的分数。 【讨论提问】 现在我们要构建一个文库，如哺乳动物，其基因组大小为 3x109，插入片段为 17kb，那么 构建的基因组文库有多少个克隆？ N=ln(1-p)/ln(1-f) =ln(1-0.99)/ln[1-(1.7x104 /3x109 ]=8.1x105 【本课小结】 1. 分离目的基因的几种常见方法