基因工程学教案CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCI(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性：NaCI提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中：CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离：β-疏基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醒，避免褐变，使酚容易去除改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染：同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。步骤：口CTAB法流程图植物材料酒精沉淀裂解液-→1液氨研磨抽提离心洗涤DNA溶液→1文上层溶液细胞裂解干燥溶解【讨论提问】（师生互动）1）用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质：2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。2）氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点：加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）-11-
基因工程学教案 - 11 - CTAB 提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase 活性； NaCl 提供一个高盐环境，使 DNP 充分溶解，在于液相中； CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 改进配方 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效 去除多酚，减少 DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 步骤： 【讨论提问】（师生互动） 1）.用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于 蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2 抑制了 DNase 的降解作用。缺点：1.能溶 解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA。2.不能完全抑制 RNase 的活性。 2）.氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
基因工程学教案3）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4）用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCI或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。2.动物基因组DNA提取代表方法SDS法原理：SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸；通过提高盐浓度并降低温度，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小，从而使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。提取缓冲液配方：100mmol /LTris-cl(pH=8）50 mmol/L E D T A (Ph=8)500mmol/LNaCl10mmol/Lβ一巯基乙醇步骤：口SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织抽提每心洗涤11上层溶液组织勾浆十11→DNA溶液细胞裂解酒精沉3.质粒DNA的提取碱裂解法原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，- 12 -
基因工程学教案 - 12 - 3）. 用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为 什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张 力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的 水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 4）.用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc，Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥 力，而易于聚集沉淀。 2.动物基因组 DNA 提取代表方法 SDS 法 原理： SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细 胞，使染色体离析、蛋白变性，同时 SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物，释放 出核酸；通过提高盐浓度并降低温度，使 SDS-蛋白质复合物的溶解度变得更小， 从而使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的 DNA 用 酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 提取缓冲液配方： 100 mmol／ＬＴris-cl（pH=8） 50 mmol/Ｌ ＥＤＴＡ（Ph=8） 500 mmol/ＬＮaＣl 10 mmol/Ｌ β－巯基乙醇 步骤： 3. 质粒 DNA 的提取 碱裂解法 原理： 碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株
基因工程学教案所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。配方及各组分作用溶液IpH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris一HCI）；溶液I可成批配制，在10Ibf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于4℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2十和Mg2十等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都鳌合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。溶液II：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，现配。要新配置溶液IⅡI是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4NNaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-..R十-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。溶液IⅢl：pH4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH20）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶- 13 -
基因工程学教案 - 13 - 所得产物经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量 制备。 十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性。用 SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释 放出质粒 DNA 和染色体 DNA，两种 DNA 在强碱环境都会变性。由于质粒和 主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不 分开；但后者完 全变性分甚至出现断裂，因此，当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降 低溶液 pH 值，使溶液 pH 值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链 可迅速复性恢复双 链结构，但是主染色体 DNA 则难以复性。在离心时，大部 分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒 DNA 留在 上清夜中。再由异丙醇沉 淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA。碱裂解法 提取的质粒 DNA 可直接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析等。 配方及各组分作用： 溶液Ｉ:pH8.0 GET 缓冲液（50mmol 葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在 10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌 15min，贮存于４℃。 葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶 液 的粘度，维持渗透压及防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA 是 Ca2 ＋ 和 Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I 中加入 EDTA，是要把大肠杆 菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制 DNase 对 DNA 的降解和抑 制微生物生长的作用。 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含 1%的 SDS)，现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避 免 NaOH 接触空气中的 CO2 而 减弱了碱性。 NaOH 是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到 了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化。用不新鲜的 0.4 N NaOH，即便有 SDS 也无法有效溶 解大肠杆菌。 SDS 是离子型表面活性剂。它主要作用是：a 溶解细胞膜上的脂质与蛋白， 从而破坏细胞膜。b 解聚细胞中的 核蛋白。c 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-.R ＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS 能抑制核糖核酸酶的作用， 所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。 溶液Ⅲ：pH4.8 乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml 冰醋酸，28.5mlH2O）； 该溶液钾离子浓度为 3mol/L，醋酸根离子浓度为 5mol/L.pH4.8 的乙酸钾溶液是 为了把抽提液的 pH 调至中性，从而使变性的质粒 DNA 复性，且稳定存在。溶
基因工程学教案液ⅢI加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS一蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。步骤：口碱裂解法流程图对数期菌体上清液沉淀溶液I充分重悬抽提干燥溶解溶液Ⅱ裂解酒精沉淀质粒DNA溶液溶液Ⅲ中和离心洗涤【讨论提间】（师生互动）提取出基因组DNA及质粒之后，如何判断我们所得到的核酸好坏？有两种方法，一种是琼脂糖凝胶电泳，一种就是紫外分光光度计法。给学生展示不同的DNA电泳图片，讲解什么样的结果是好的紫外分光光度计法。纯DNA：OD260/OD280~1.8(>1.9,表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）二、RNA 提取 trizol法原理Trizol试剂是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品- 14 -
基因工程学教案 - 14 - 液 III 加入后的沉淀实际上是 K+置换了 SDS 中的 Na+形成了不溶性的 PDS，而 高浓度的盐有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白复合物凝 聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合， 后者是因为盐与 SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。 步骤： 【讨论提问】（师生互动） 提取出基因组 DNA 及质粒之后，如何判断我们所得到的核酸好坏？ 有两种方法，一种是琼脂糖凝胶电泳，一种就是紫外分光光度计法。 给学生展示不同的 DNA 电泳图片，讲解什么样的结果是好的 紫外分光光度计法。 纯 DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有 RNA 污染；＜1.6，表明有蛋白 质、酚等污染） 二、RNA 提取 trizol 法 原理 Trizol 试剂是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总 RNA 提取出来。直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。它在破碎和溶解细 胞时能保持 RNA 的完整性，裂解细胞并释放出 RNA,酸性条件使 RNA 与 DNA 分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集 上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品
基因工程学教案中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。步骤纯化氯仿RNA+水相离心基因组DNA有机相加入裂解液(TRNzol)pH5.7传统方法：有机溶剂抽提，得率高等体积异丙醇沉淀晾干溶解?70%乙醇洗涤沉淀水相保存柱纯化法：纯度高RNARNA吸附柱+去蛋白液、漂洗+洗脱3.总RNA的纯化及获得检测1）电泳在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S.18S和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2倍左右，说明RNA保持完整。2）紫外分光光度计法纯RNA=2.0：1.7<OD260/OD280<2.0（<1.7时表明有蛋白质或酚污染：>2.0时表明可能有异硫氰酸残存）【讨论提问】（师生互动）RNA不稳定，我们提取分离的时候要怎么避免？- 15 -
基因工程学教案 - 15 - 中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA， 在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 步骤 检测 1） 电泳 在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分 别是 28S,18S 和 5S，其中 18S 和 28S 的条带明显清晰，而 5S 的带比较弱，28S 的带的亮度是 18S 带亮度的 2 倍左右，说明 RNA 保持完整。 2） 紫外分光光度计法 纯 RNA=2.0：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7 时表明有蛋白质或酚污 染；＞2.0 时表明可能有异硫氰酸残存） 【讨论提问】（师生互动） RNA 不稳定，我们提取分离的时候要怎么避免？