基因工程学教案2.基因文库、基因组文库、cDNA文库概念3.基因组文库构建过程及各个过程中注意事项4.基因组文库完整性如果确定cDNA文库的完整性如何确定5.6.一个有质量的基因文库的标准7.构建基因文库与cDNA文库的优缺点？【课后作业】1.．基因文库的构建流程及其注意事项2.基因组文库和cDNA文库的优缺点3.观看基因文库构建视频，去土豆和优酷上找教学反思基因文库构建的过程还应该再找个视频，因为这个实验学生没有做过，比较陌生。另外由于这届学生比较特殊，是大四开课，分子生物学没有学，所以相对来说，要慢点细点讲。授课题目3.2PCR技术授课序次690分钟总学时数2学时授课时长备注教学过程及授课内容【课堂导入】学生活创设情境（或旧知识回顾），导入新课动：教师活动：联系生活实际，讲述学习PCR技术的必要性。【探究新知】学习新课（主要部分）学生活动教师活动1：1:【提问】回顾：DNA的体内复制过程。-21-
基因工程学教案 - 21 - 2. 基因文库、基因组文库、cDNA 文库概念 3. 基因组文库构建过程及各个过程中注意事项 4. 基因组文库完整性如果确定 5. cDNA 文库的完整性如何确定 6. 一个有质量的基因文库的标准 7. 构建基因文库与 cDNA 文库的优缺点？ 【课后作业】 1. 基因文库的构建流程及其注意事项 2. 基因组文库和 cDNA 文库的优缺点 3. 观看基因文库构建视频，去土豆和优酷上找 教学反思 基因文库构建的过程还应该再找个视频，因为这个实验学生没有做过，比较陌生。另外由 于这届学生比较特殊，是大四开课，分子生物学没有学，所以相对来说，要慢点细点讲。 授课题目 3.2 PCR 技术 授课序次 6 总学时数 2 学时 授课时长 90 分钟 教学过程及授课内容 备注 【课堂导入】 创设情境（或旧知识回顾），导入新课 教师活动： 联系生活实际，讲述学习 PCR 技术的必要性。 【探究新知】 学习新课（主要部分） 教师活动 1： 【提问】回顾：DNA 的体内复制过程。 学生活 动： 学生活动 1：
基因工程学教案【图片展示】【思考回【视频展示】：答】、【观看图观看PCR视频5分钟【讲解】片1、2.2.1PCR的基本原理【观看视PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷频】酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段【观察与与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸"三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我记录】、们所需的大量的特定基因片段。2.2.2PCR反应程序变性(denaturation）即双链DNA在94C下通过热变性使其双链间氢键断学生活动裂而解离成单链。退火(annealling）即当变性温度突然降至引物Tm值以下时,引物与模板2:DNA互补序列杂交。由于模板DNA分子结构远复杂于引物结构,且反应体系中【观看实物】引物DNA分子的摩尔数远大于模板DNA,故在退火温度下引物与模板DNA分【观看图子可形成互补的杂交链，而单链模板DNA间互补形成双链的机会要少的多。片1、延伸(extension）即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的条件下,DNA聚合酶依赖其5→3的聚合酶活力,以引物为起始,互补的DNA链为模板,使引物序列得以延伸,形成模板DNA的互补链。94℃变性3min，94℃45秒，64℃1分钟，72℃1分钟，30个循环。72℃5-10min2.2.3PCR反应的体系ddH2015μl2μl10xPCRBufferdNTP(10mM each)0.5μl0.5μlPrimer I(20μM)0.5μlPrimer 2(20μM)1μl模板DNA(50ng)D16ExTaqDNA聚合酶（2.5U）0.5μl总体积20μl- 22 -
基因工程学教案 - 22 - 【图片展示】 【视频展示】： 观看 PCR 视频 5 分钟 【讲解】 2.2.1 PCR 的基本原理 PCR 是一种体外 DNA 扩增技术，是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷 酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的 DNA 片段 与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步 反应的多次循环，使 DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我 们所需的大量的特定基因片段。 2.2.2 PCR 反应程序 变性(denaturation) 即双链 DNA 在 94℃下通过热变性使其双链间氢键断 裂而解离成单链。 退火(annealling) 即当变性温度突然降至引物 Tm 值以下时,引物与模板 DNA 互补序列杂交。由于模板 DNA 分子结构远复杂于引物结构,且反应体系中 引物 DNA 分子的摩尔数远大于模板 DNA,故在退火温度下引物与模板 DNA 分 子可形成互补的杂交链,而单链模板 DNA 间互补形成双链的机会要少的多。 延伸(extension) 即在 DNA 聚合酶、4 种脱氧核糖核苷酸、底物及 Mg2+存 在的条件下,DNA 聚合酶依赖其 5 → 3 的聚合酶活力,以引物为起始,互补的 DNA 链为模板,使引物序列得以延伸,形成模板 DNA 的互补链。 94℃变性 3min， 94℃45 秒，64℃ 1 分钟，72℃ 1 分钟，30 个循环。 72℃ 5-10 min 2.2.3 PCR 反应的体系 ddH20 15μl 10×PCR Buffer 2μl dNTP(10mM each) 0.5μl Primer l(20μM) 0.5μl Primer 2(20μM) 0.5μl 模板 DNA (50ng)D16 ExTaq DNA 聚合酶（2.5U） 1μl 0.5μl 总体积 20μl 【思考回 答】、 【观看图 片】、 【观看视 频】 【观察与 记录】、 学生活动 2： 【观看实 物】 【观看图 片】
基因工程学教案教师活动2：实物（引物说明书）展示【图片展示】【讲解】2.2.4PCR引物的设计一般原则①引物长度一般以18-30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。②引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区，以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性③引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。引物3'端的头1-2个碱基会影响TaqDNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性，因此选择合适的3'端碱基很重要。最好选T、C、G，不选A。④引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列（如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等），便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。在与模板结合的引物长度足够的条件下，其5'端碱基互补程度无严格限制。③引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应无回文结构。避免同一引物自身3'末端碱基序列的互补形成发卡结构。③要避免两个引物间有互补序列，特别是3'末端碱基序列互补以免形成引物二聚体”，浪费引物。引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40-60%之间。2.2.4其他常见PCR荧光定量PCR反向PCR多重PCR巢式PCR- 23
基因工程学教案 - 23 - 教师活动 2： 实物（引物说明书）展示 【图片展示】 【讲解】 2.2.4 PCR 引物的设计一般原则 ①引物长度一般以 18-30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的 退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 ②引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物的序列应选定基因组 DNA 的 高度保守区，以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性 ③引物 3`末端碱基一般应与模板 DNA 严格配对，并且 3`末端为 G、C 或 T 时 引发效率较高。引物 3′端的头 1-2 个碱基会影响 Taq DNA 聚合酶的延伸效率， 从而影响 PCR 反应的扩增效率及特异性，因此选择合适的 3′端碱基很重要。最 好选 T、C、G，不选 A。 ④引物 5`末端碱基可不与模板 DNA 匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性 核酸内切酶的识别序列、ATG 起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达， 但其保护碱基有一定的要求。在与模板结合的引物长度足够的条件下，其 5′端 碱基互补程度无严格限制。 ⑤引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应无回文结构。 避免同一引物自身 3`末端碱基序列的互补形成发卡结构。 ⑥要避免两个引物间有互补序列，特别是 3`末端碱基序列互补以免形成“引物 二聚体”，浪费引物。 ⑦引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 G/C 和 A/T 碱基均匀分布， G+C 含量在 40-60%之间。 2.2.4 其他常见 PCR 荧光定量 PCR 反向 PCR 多重 PCR 巢式 PCR
基因工程学教案不对称PCRRACEPCR【讨论提间】为什么引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对？【本课小结】2.2PCR技术2.2.1PCR的基本原理2.2.2PCR反应的程序2.2.3PCR反应体系2.2.4PCR引物的设计一般原则2.2.5常见PCR【课后作业】思考题：PCR引物的设计一般原则有哪些？各种常见PCR与普通PCR有什么不同教学反思应加强对各种常见PCR的理解及其应用。最后能收集一些视频，对理解操作很有用途。对引物设计来说，要课后加强应用练习。授课题目3.3其他方法授课序次总学时数2学时授课时长90分钟备注教学过程及授课内容【课堂导入】学生活前面已经学习过两种主要的分离目的基因的方法，那么还要一些方法大家需要动：了解，分别是化学合成法，Genbank数据库中分离及蛋白质工程。【探究新知】化学合成目的基因- 24 -
基因工程学教案 - 24 - 不对称 PCR RACE PCR 【讨论提问】 为什么引物 3`末端碱基一般应与模板 DNA 严格配对？ 【本课小结】 2.2 PCR 技术 2.2.1 PCR 的基本原理 2.2.2 PCR 反应的程序 2.2.3 PCR 反应体系 2.2.4 PCR 引物的设计一般原则 2.2.5 常见 PCR 【课后作业】 思考题：PCR 引物的设计一般原则有哪些？ 各种常见 PCR 与普通 PCR 有什么不同？ 教学反思 应加强对各种常见 PCR 的理解及其应用。最后能收集一些视频，对理解操作很有用途。对 引物设计来说，要课后加强应用练习。 授课题目 3.3 其他方法 授课序次 7 总学时数 2 学时 授课时长 90 分钟 教学过程及授课内容 备注 【课堂导入】 前面已经学习过两种主要的分离目的基因的方法，那么还要一些方法大家需要 了解，分别是化学合成法，Genbank 数据库中分离及蛋白质工程。 【探究新知】 化学合成目的基因 学生活 动：
基因工程学教案一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法、固相磷酸三酯合成法目前通用的合成方法。1原理磷酸二酯法②带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5保护的单核苷酸与带3'保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。合成过程下一个5"端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。二、Genbank法GenBank数据库是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）维护的一级核酸序列数据库。GenBank数据库的数据来源有三种：GenBank数据库的数据来源有三种：1、直接来源于测序工作者提交的序列；2、与其它数据机构协作交换的数据；3、美国专利局提供的专利数据。NCBI网站网址：http://www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov核苷酸序列数据库分为三个子数据库：核苷酸序列数据库分为三个子数据库：EST：表达序列标记数据库GSS基因组测序序列数据库CoreNucleotide包含所有未被以上两个子数据库收录的核苷酸序列核苷酸序列数据库。三、通过蛋白质工程改造目的基因【讨论提问】为什么要进行蛋白质工程改造？一些蛋白质只是适合生物的需要，但是不符合人类的需要，因此需要对其进行改造，举例，胰岛素。目的：是生产符合人类需要的蛋白质。定义：以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物- 25 -
基因工程学教案 - 25 - 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法自动化合成法、 固相磷酸三酯合成法目前通用的合成方法。 1 原理 磷酸二酯法②带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带 5’保护的单 核苷酸与带 3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。合成过程下一个 5’端保护的单核苷酸又可以同 3’端保护的二核苷酸聚合原理与磷酸二酯法一 样。只是参加反应的单核苷酸都是在 3’端磷酸和 5’-OH 上都先连接了一个保护 基团。 二、Genbank 法 GenBank 数据库是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）维护的一级核酸序列 数据库。 GenBank 数据库的数据来源有三种：GenBank 数据库的数据来源有三种： 1、直接来源于测序工作者提交的序列； 2、与其它数据机构协作交换的数据； 3、美国专利局提供的专利数据。 NCBI 网站网址：http://www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov 核苷酸序列数据库分为三个子数据库：核苷酸序列数据库分为三个子数据库： EST :表达序列标记数据库 GSS :基因组测序序列数据库 CoreNucleotide : 包含所有未被以上两个子数据库收录的核苷酸序列核苷酸序列数据库。 三、通过蛋白质工程改造目的基因 【讨论提问】 为什么要进行蛋白质工程改造？ 一些蛋白质只是适合生物的需要，但是不符合人类的需要，因此需要对 其进行改造，举例，胰岛素。目的：是生产符合人类需要的蛋白质。 定义：以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物