第一章综合性实验第一节病原生物的分布与检查在土壤、水、空气、动植物和人体体表及与外界相通的腔道中，存在着许多种类不同的病原生物。了解病原生物的分布以及其与人类的关系，对建立无菌观念、严格无菌操作、预防感染和相关病原生物检查具有重要意义。实验一微生物的分布与检查【问题·思考】1，在微生物学实验中，你认为该如何避免杂菌的污染？2.空气、水、地面以及人体体表通常采取何种方法进行消毒灭菌？3.你认为可引起外科手术切口术后感染的细菌主要有哪些？0000000000一、空气中微生物的分布与检查【目的】1.学会空气中微生物的检测方法。2.了解空气中的微生物及其对人类的危害。【材料】普通琼脂平板、酒精灯、37℃培养箱等。【方法】采用自然沉降法检测。取普通琼脂平板1个，在室内任选一处，距离地面垂直高度80～150cm处，打开平板盖，暴露于空气中5~10min，然后盖好盖，置37℃培养箱培养18~24h后，观察结果。【结果观察菌落特点，并记录菌落数。（注意事项）采样前，关好门窗，在无人走动情况下，采集样本。二、水中微生物的分布与检查【目的】1.学会水中微生物的检测方法。2.了解水中的细菌及其对人类的危害。【材料】高层琼脂培养基、75mm无菌空培养Ⅲ、无菌试管、无菌吸管、池塘水、自来水、酒精灯、试管架、特种铅笔、消毒缸、37℃培养箱等。【方法】1.用无菌吸管分别吸取池塘水和自来水各1ml放入2只无菌空培养皿中。2.取2支融化且已冷却至45℃左右的高层琼脂培养基9ml，分别倾入步骤1中的2只培养皿内，转动平板混匀，待琼脂凝固后，贴标签，将平板倒置于:1
第一章 综合性实验 ·1· 第一章 综合性实验 第一节 病原生物的分布与检查 在土壤、水、空气、动植物和人体体表及与外界相通的腔道中，存在着许多 种类不同的病原生物。了解病原生物的分布以及其与人类的关系，对建立无菌观 念、严格无菌操作、预防感染和相关病原生物检查具有重要意义。 实验一 微生物的分布与检查 【问题·思考】 1. 在微生物学实验中，你认为该如何避免杂菌的污染？ 2. 空气、水、地面以及人体体表通常采取何种方法进行消毒灭菌? 3. 你认为可引起外科手术切口术后感染的细菌主要有哪些？ 一、空气中微生物的分布与检查 【目的】 1. 学会空气中微生物的检测方法。 2. 了解空气中的微生物及其对人类的危害。 【材料】 普通琼脂平板、酒精灯、37℃培养箱等。 【方法】 采用自然沉降法检测。取普通琼脂平板 1 个，在室内任选一处， 距离地面垂直高度 80～150cm 处，打开平板盖，暴露于空气中 5～10min，然后 盖好盖，置 37℃培养箱培养 18～24h 后，观察结果。 【结果】 观察菌落特点，并记录菌落数。 【注意事项】 采样前，关好门窗，在无人走动情况下，采集样本。 二、水中微生物的分布与检查 【目的】 1. 学会水中微生物的检测方法。 2. 了解水中的细菌及其对人类的危害。 【材料】 高层琼脂培养基、75mm 无菌空培养皿、无菌试管、无菌吸管、 池塘水、自来水、酒精灯、试管架、特种铅笔、消毒缸、37℃培养箱等。 【方法】 1. 用无菌吸管分别吸取池塘水和自来水各 1ml 放入 2 只无菌空培养皿中。 2. 取 2 支融化且已冷却至 45℃左右的高层琼脂培养基 9ml，分别倾入步骤 1 中的 2 只培养皿内，转动平板混匀，待琼脂凝固后，贴标签，将平板倒置于 ·1·
·2病原生物学与免疫学实验一一综合创新篇37℃培养箱培养1824h后，观察结果。【结果】观察并记录菌落数。【注意事项】1.观察菌落时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。2.如1ml水中菌落数太多无法计数，需将样本按一定比例稀释后再重新培养计数。3.采集自来水样本时，先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧无菌后，再开水龙头使水流5min，以无菌三角烧瓶取水样备用；采集池塘水样本时，应取水面下10～15cm的深层水样备用。三、土壤中微生物的分布与检查【目的】1.学会土壤中微生物的检测方法。2.了解十壤中细菌及对人类的危害。【材料】普通琼脂平板、无菌生理盐水、泥土、无菌吸管、无菌棉签、37℃培养箱等。【方法】1.取地面下10cm处的泥土1g，与10ml无菌生理盐水按1：10混匀，静置数分钟后，备用。2.用无菌吸管吸取上清液0.1ml，放入于普通琼脂平板表面，再用无菌棉签涂布均匀，置37℃培养箱培养24h后：观察结果。结果）观察菌落生长情况，并记录菌落数。【注意事项】1.由于日光中紫外线及含水量等原因，地表面泥土含菌量不能代表土壤中微生物，因此，样品采集应该取5～20cm土壤部面，且多点采集，混匀后取样本，装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存，备用。2.土壤中微生物种类多（如细菌、放线菌、霉菌等），要配制多种适宜培养基进行培养鉴定。四、皮肤、黏膜及其他物品表面微生物的分布与检查【目的】1.学会正常人体及物品上微生物的检测方法。2.了解正常人体及物品上微生物的分布。【材料】普通琼脂平板、无菌生理盐水、棉签、相应物品、特种铅笔、酒精灯、37℃培养箱等。【方法】1.取一只普通琼脂平板，用特种铅笔在平板底外部分别标注皮肤、黏膜及
·2· 病原生物学与免疫学实验——综合创新篇 37℃培养箱培养 18～24h 后，观察结果。 【结果】 观察并记录菌落数。 【注意事项】 1. 观察菌落时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。 2. 如 1ml 水中菌落数太多无法计数，需将样本按一定比例稀释后再重新培 养计数。 3. 采集自来水样本时，先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧无菌后，再开水 龙头使水流 5min，以无菌三角烧瓶取水样备用；采集池塘水样本时，应取水面 下 10～15cm 的深层水样备用。 三、土壤中微生物的分布与检查 【目的】 1. 学会土壤中微生物的检测方法。 2. 了解土壤中细菌及对人类的危害。 【材料】 普通琼脂平板、无菌生理盐水、泥土、无菌吸管、无菌棉签、 37℃培养箱等。 【方法】 1. 取地面下 10cm 处的泥土 1g，与 10ml 无菌生理盐水按 l∶10 混匀，静置 数分钟后，备用。 2. 用无菌吸管吸取上清液 0.1ml，放入于普通琼脂平板表面，再用无菌棉签 涂布均匀，置 37℃培养箱培养 24h 后，观察结果。 【结果】 观察菌落生长情况，并记录菌落数。 【注意事项】 1. 由于日光中紫外线及含水量等原因，地表面泥土含菌量不能代表土壤中 微生物，因此，样品采集应该取 5～20 cm 土壤剖面，且多点采集，混匀后取样 本，装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存，备用。 2. 土壤中微生物种类多（如细菌、放线菌、霉菌等），要配制多种适宜培养 基进行培养鉴定。 四、皮肤、黏膜及其他物品表面微生物的分布与检查 【目的】 1. 学会正常人体及物品上微生物的检测方法。 2. 了解正常人体及物品上微生物的分布。 【材料】 普通琼脂平板、无菌生理盐水、棉签、相应物品、特种铅笔、酒 精灯、37℃培养箱等。 【方法】 1. 取一只普通琼脂平板，用特种铅笔在平板底外部分别标注皮肤、黏膜及
第一章综合性实验·3·相应物品名，然后反转平板。2.用手指指腹在“皮肤”标志处的琼脂上轻轻擦拭。3.用蘸取了无菌生理盐水的湿棉签擦拭咽部或鼻腔处的黏膜，然后轻轻抹在“黏膜”标志处的琼脂上。4.分别将相应物品如钱市、卡等平整面在不同琼脂培养基的区域轻轻擦式。5.盖好皿盖、贴标签、送37℃培养箱培养18～24h后，观察结果。【结果观察琼脂平板上细菌生长现象，并记录正常人体皮肤、黏膜及物品表面的菌落数。【注意事项】1.无菌操作，采样要用湿润的无菌棉签，不能使用十的无菌棉签。2.所采样本应及时检测，室温下存放不得超过2h，4℃冰箱存放不得超过4h。3.根据需要，可选用血平板或同时使用两种培养平板进行实验。【实验报告】1.记录空气中微生物的分布与检查的结果并分析讨论。2.记录水中微生物的分布与检查的结果并分析讨论。3.记录土壤中微生物的分布与检查的结果并分析讨论。4.记录皮肤、黏膜及其它物品表面微生物的分布与并分析讨论。实验二寄生虫的分布与检查【问题·思考】1完成生活史离不开水源的寄生虫有哪些？影响其分布的因素是什么？2.我国土源性寄生虫有哪些？它们在外界的发育类型有何不同？3.我国血吸虫的分布特点及原因是什么？如果你作为国家卫生部指派的血吸虫病流行区调查员，会如何开展某地区的血吸虫病检查工作？0000000000000000000000000000000000000000000000一、土壤中寄生虫的分布与检查土源性蠕虫如蚂虫和钩虫等，其虫卵随人粪便排出体外，在十壤中发育成感染性虫卵或幼虫。以检查壤中蛔虫卵为例介绍壤中寄生虫的检测方法。【目的】学习土壤中寄生虫的检查方法。【材料）铜筛（2mm和3mm）、5%NaOH、饱和硝酸钠溶液、离心管（50ml）、离心机、显微镜、载玻片和盖玻片等。【方法】采用饱和改良硝酸钠漂浮法分离、镜检。1.从作物由取表层至表层以下5cm处的土壤，庭院、厕所和厨房等取表层土，晾干、研细。2.用3mm和2mm的铜筛依次过滤，收集细土作为样本
第一章 综合性实验 ·3· 相应物品名，然后反转平板。 2. 用手指指腹在“皮肤”标志处的琼脂上轻轻擦拭。 3. 用蘸取了无菌生理盐水的湿棉签擦拭咽部或鼻腔处的黏膜，然后轻轻抹 在“黏膜”标志处的琼脂上。 4. 分别将相应物品如钱币、卡等平整面在不同琼脂培养基的区域轻轻擦拭。 5. 盖好皿盖、贴标签、送 37℃培养箱培养 18～24h 后，观察结果。 【结果】 观察琼脂平板上细菌生长现象，并记录正常人体皮肤、黏膜及物 品表面的菌落数。 【注意事项】 1. 无菌操作，采样要用湿润的无菌棉签，不能使用干的无菌棉签。 2. 所采样本应及时检测，室温下存放不得超过 2h，4℃冰箱存放不得超过 4h。 3. 根据需要，可选用血平板或同时使用两种培养平板进行实验。 【实验报告】 1. 记录空气中微生物的分布与检查的结果并分析讨论。 2. 记录水中微生物的分布与检查的结果并分析讨论。 3. 记录土壤中微生物的分布与检查的结果并分析讨论。 4. 记录皮肤、黏膜及其它物品表面微生物的分布与并分析讨论。 实验二 寄生虫的分布与检查 【问题·思考】 1. 完成生活史离不开水源的寄生虫有哪些？影响其分布的因素是什么？ 2. 我国土源性寄生虫有哪些？它们在外界的发育类型有何不同？ 3. 我国血吸虫的分布特点及原因是什么？如果你作为国家卫生部指派的 血吸虫病流行区调查员，会如何开展某地区的血吸虫病检查工作？ 一、土壤中寄生虫的分布与检查 土源性蠕虫如蛔虫和钩虫等，其虫卵随人粪便排出体外，在土壤中发育成感 染性虫卵或幼虫。以检查土壤中蛔虫卵为例介绍土壤中寄生虫的检测方法。 【目的】 学习土壤中寄生虫的检查方法。 【材料】 铜筛（2mm 和 3mm）、5%NaOH、饱和硝酸钠溶液、离心管 （50ml）、离心机、显微镜、载玻片和盖玻片等。 【方法】 采用饱和改良硝酸钠漂浮法分离、镜检。 1. 从作物田取表层至表层以下 5cm 处的土壤，庭院、厕所和厨房等取表层 土，晾干、研细。 2. 用 3mm 和 2mm 的铜筛依次过滤，收集细土作为样本
·4·病原生物学与免疫学实验一一综合创新篇3.每10g样本放人1支50ml离心管，加5%Na0H至40ml，盖紧管口用力振摇，充分混匀后，2000rpm离心4min。4.弃去上清液，加入饱和硝酸钠溶液至管口，覆上盖玻片，静置15min后取下盖玻片置于载玻片上镜检。【结果】蛔虫虫卵有受精卵和未受精卵两种，具体形态结构详见基础篇第二章第四节。【注意事项】1.由于虫卵在土壤中的分布不均，土样的选择与虫卵的筛选要尽量做到多地点多批次，防止漏查。2.操作者需佩戴手套和胶鞋，注意自我保护。二、水中寄生虫的分布与检查寄生虫污染水源，人通过接触疫水或生饮水而感染。水中可能存在的寄生虫有隐孢子虫、贾第虫和日本血吸虫等。【目的】学习水中寄生虫的检查方法。【材料】滤膜、离心机、载玻片、烧杯、恒温箱（带光源）显微镜等。【方法】1.离心沉淀法用清洁的容器采集10～20L水样，小样本采用离心沉淀法收集样本，大样本经过滤法收集样本。处理后的样本直接镜检或经涂片、固定、染色后再进行形态鉴定。2.压碎法或逸坳法日本血吸虫流行区水源的检测采用查螺的方法进行调查。江湖洲滩环境框线距20～50m，其他环境框线距5～10m，检获框内全部钉螺，进一步进行实验室检测。（1）压碎法：将钉螺置于载玻片，另取一张较厚的玻片轻轻压碎，在螺体上滴一滴去氯水，置于解剖镜下观察。（2）逸蚜法：将钉螺放人水中，置于20～25℃光照条件下，观察是否有尾逸出（具体方法见日本血吸虫模型制备章节）。【结果】可能查到隐孢子虫卵囊、贾第虫或溶组织内阿米巴包囊、蠕虫卵和日本血吸虫尾蝴等。【注意事项】1.多点、多批次、多时间采集水源，同时保证水样安全迅速地送往实验室。2.实验中所用器血及桌面等在实验后必须严格进行消毒处理。3.疫水中可能含有具有感染性的寄生虫，操作者应佩戴一次性手套和口罩，以防感染
·4· 病原生物学与免疫学实验——综合创新篇 3. 每 10g 样本放入 1 支 50ml 离心管，加 5% NaOH 至 40ml，盖紧管口用力 振摇，充分混匀后，2000rpm 离心 4min。 4. 弃去上清液，加入饱和硝酸钠溶液至管口，覆上盖玻片，静置 15min 后 取下盖玻片置于载玻片上镜检。 【结果】 蛔虫虫卵有受精卵和未受精卵两种，具体形态结构详见基础篇第 二章第四节。 【注意事项】 1. 由于虫卵在土壤中的分布不均，土样的选择与虫卵的筛选要尽量做到多 地点多批次，防止漏查。 2. 操作者需佩戴手套和胶鞋，注意自我保护。 二、水中寄生虫的分布与检查 寄生虫污染水源，人通过接触疫水或生饮水而感染。水中可能存在的寄生虫 有隐孢子虫、贾第虫和日本血吸虫等。 【目的】 学习水中寄生虫的检查方法。 【材料】 滤膜、离心机、载玻片、烧杯、恒温箱（带光源）、显微镜等。 【方法】 1. 离心沉淀法 用清洁的容器采集 10～20L 水样，小样本采用离心沉淀法 收集样本，大样本经过滤法收集样本。处理后的样本直接镜检或经涂片、固定、 染色后再进行形态鉴定。 2. 压碎法或逸蚴法 日本血吸虫流行区水源的检测采用查螺的方法进行 调查。 江湖洲滩环境框线距 20～50m，其他环境框线距 5～10m，检获框内全部钉 螺，进一步进行实验室检测。 （1）压碎法：将钉螺置于载玻片，另取一张较厚的玻片轻轻压碎，在螺体 上滴一滴去氯水，置于解剖镜下观察。 （2）逸蚴法：将钉螺放入水中，置于 20～25℃光照条件下，观察是否有尾 蚴逸出（具体方法见日本血吸虫模型制备章节）。 【结果】 可能查到隐孢子虫卵囊、贾第虫或溶组织内阿米巴包囊、蠕虫卵 和日本血吸虫尾蚴等。 【注意事项】 1. 多点、多批次、多时间采集水源，同时保证水样安全迅速地送往实验室。 2. 实验中所用器皿及桌面等在实验后必须严格进行消毒处理。 3. 疫水中可能含有具有感染性的寄生虫，操作者应佩戴一次性手套和口 罩，以防感染
第一章综合性实验·5·三、皮肤及其他物品表面寄生虫的分布与检查人体皮肤常有螨虫寄生，但无临床症状。另外，有一些寄生虫虫卵（如蛔虫和虫等）可黏附于儿童手部和课桌、玩具等物品，造成寄生虫在人群的流行。【目的】学习人体及物品表面寄生虫的检查方法。【材料】透明胶纸、载玻片和显微镜等。【方法】采用透明胶纸法粘拭皮肤或物品后，进行镜检。【结果】可能查到的寄生虫有蛳虫卵、钩虫卵、晓虫卵以及形螨等。【注意事项】采集的样本应及时检测。【实验报告】记录土壤中寄生虫检查的结果并分析讨论。（何静妹孔德龙）第二节呼吸道感染标本的病原生物检查呼吸道感染包括上呼吸道感染和下呼吸道感染，可由多种病原体感染引起。引起鼻、咽、喉等上呼吸道感染的病原体多为细菌和病毒；引起气管、支气管及肺泡等下呼吸道感染的病原体包括细菌、病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、立克次体、真菌和寄生虫等。正确采集标本并进行培养鉴定对疾病的诊断具有重要意义。【问题·思考】1.呼吸道标本如何正确取材进行病原生物学检查？2.若怀疑结核分枝杆菌感染，如何取材并最终鉴定？3.疑似呼吸道感染由病毒引起时，可以采用何种方法鉴定？0000000000000000000【目的】1.明确呼吸道标本的病原体检查一般程序和方法。2.学习呼吸道标本的采集方法。【材料】1.标本鼻咽拭子、咽拭子、痰液标本、患者早期的含漱液。2.培养基血平板、巧克力平板、亚碲酸钾血平板、罗氏培养基、鲍-金培养基及卵黄双抗平板沙保弱氏培养基、细胞培养基等。3.试剂革兰染色液、抗酸染色液、1%胰酶溶液、氧化酶试剂、抗“0”试剂盒、10%去氧胆酸钠溶液、1%羊细胞悬液溶血素、PCR试剂盒、2%和10%NaOH溶液、无菌生理盐水、青每素（20000U/ml）、链素（20000U/ml）等。4.鸡胚与细胞9～11d龄的鸡胚、0.5%的鸡红细胞。5.其他载玻片、盖玻片、烧杯、玻璃棒、无菌离心管、普通培养箱、CO2培养箱、显微镜等
第一章 综合性实验 ·5· 三、皮肤及其他物品表面寄生虫的分布与检查 人体皮肤常有螨虫寄生，但无临床症状。另外，有一些寄生虫虫卵（如蛔虫 和蛲虫等）可黏附于儿童手部和课桌、玩具等物品，造成寄生虫在人群的流行。 【目的】 学习人体及物品表面寄生虫的检查方法。 【材料】 透明胶纸、载玻片和显微镜等。 【方法】 采用透明胶纸法粘拭皮肤或物品后，进行镜检。 【结果】 可能查到的寄生虫有蛔虫卵、钩虫卵、蛲虫卵以及蠕形螨等。 【注意事项】 采集的样本应及时检测。 【实验报告】 记录土壤中寄生虫检查的结果并分析讨论。 （何静妹 孔德龙） 第二节 呼吸道感染标本的病原生物检查 呼吸道感染包括上呼吸道感染和下呼吸道感染，可由多种病原体感染引起。引 起鼻、咽、喉等上呼吸道感染的病原体多为细菌和病毒；引起气管、支气管及肺泡 等下呼吸道感染的病原体包括细菌、病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、立克次体、 真菌和寄生虫等。正确采集标本并进行培养鉴定对疾病的诊断具有重要意义。 【问题·思考】 1. 呼吸道标本如何正确取材进行病原生物学检查？ 2. 若怀疑结核分枝杆菌感染，如何取材并最终鉴定？ 3. 疑似呼吸道感染由病毒引起时，可以采用何种方法鉴定？ 【目的】 1. 明确呼吸道标本的病原体检查一般程序和方法。 2. 学习呼吸道标本的采集方法。 【材料】 1. 标本 鼻咽拭子、咽拭子、痰液标本、患者早期的含漱液。 2. 培养基 血平板、巧克力平板、亚碲酸钾血平板、罗氏培养基、鲍-金培 养基及卵黄双抗平板沙保弱氏培养基、细胞培养基等。 3. 试剂 革兰染色液、抗酸染色液、1%胰酶溶液、氧化酶试剂、抗“O”试 剂盒、10%去氧胆酸钠溶液、1%羊细胞悬液溶血素、PCR 试剂盒、2%和 10%NaOH 溶液、无菌生理盐水、青霉素（20000U/ml）、链霉素（20000U/ml）等。 4. 鸡胚与细胞 9～11d 龄的鸡胚、0.5%的鸡红细胞。 5. 其他 载玻片、盖玻片、烧杯、玻璃棒、无菌离心管、普通培养箱、CO2 培养箱、显微镜等