且些类患儿病变肠段不仅有神经节异常,尚有肠道平滑肌,结缔组织的增生等细胞外基 质变化,单纯的神经崤细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限,另一方面能否在体內改造 病变肠段的病理变化,仍需进一步研究。 近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快,国外有人发现将表达神经营养因子的神经 干细胞直接种植于受伤的脑组织中,能促进神经功能的恢复。神经干细胞在受到碱性成 纤维细胞因子(FGF-2)和上皮细胞生长因子(EGF)刺激时可分化出神经元和胶质细胞 EGF可维持神经干细胞的生成,FGF-2对干细胞的分化起重要作用;有很多神经因子(如 血小板生长因子,转化生长因子等)对神经干细胞的分化起着协同作用。诱导分化剂维 甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用。对于HD病变肠段不仅有神经节异常,尚有肠道 平滑肌,结缔组织的增生等变化的现象,我们注意到纤溶酶原激活因子(PA)能激活纤 溶酶原,水解纤维蛋白,及细胞外基质中的纤连蛋白( fibronectin,Fn),层粘连蛋白( laminin Ln),基质金属蛋白酶(matiⅸ metalloproteinase enzyme,MMP)能分解周围组织一细胞外 基质,如将PA,MMP的cDNA转染修饰神经干细胞将有可能对HD病变段的病理变化 进行改造,有利于神经干细胞生长,发育。通过探索影响神经干细胞移植,生长,分化 的分子机制,结合基因工程技术,将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。 鉴于神经干细胞的多向分化潜能,在大脑,脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发 现,自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出4(此将为神经干细胞自体移植 提供一个很好的来源),以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗 的载体细胞,针对上面的问题我们提出如下假说:如同神经干细胞移植在恢复受损大脑 脊髓神经功能上具有良好的应用前景—样,通过眢种人工方法修饰后,神经干细胞移植 有恢复HD病变肠段的正常神经支配的可能 细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法,但目前使用的细胞 多取自胚胎,这样一方面细胞来源有限,另一方面存在异体免疫排斥作用。神经干细胞 可以在体外大量增殖,但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布,这样造 成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞,即造血干细胞和间充质干细胞 ( mesenchymal stem cell,MsC)。前者的移植已成功用于临床治疗白血病,但其移植需 要获得足够数量的造血干细胞,并且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC易于从骨髓中分 离,体外扩增简单,长期培养过程中能保持多向分化潜能。近期美国学者 Woodbury等在 3-2
且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等细胞外基 质变化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限，另一方面能否在体内改造 病变肠段的病理变化，仍需进一步研究。 近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快，国外有人发现将表达神经营养因子的神经 干细胞直接种植于受伤的脑组织中，能促进神经功能的恢复。神经干细胞在受到碱性成 纤维细胞因子（FGF-2）和上皮细胞生长因子（EGF）刺激时可分化出神经元和胶质细胞， EGF 可维持神经干细胞的生成，FGF-2 对干细胞的分化起重要作用；有很多神经因子（如 血小板生长因子，转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协同作用。诱导分化剂维 甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用[3]。对于 HD 病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道 平滑肌，结缔组织的增生等变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子（PA）能激活纤 溶酶原，水解纤维蛋白，及细胞外基质中的纤连蛋白(fibronectin, Fn)，层粘连蛋白（laminin， Ln），基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme, MMP）能分解周围组织—细胞外 基质，如将 PA，MMP 的 cDNA 转染修饰神经干细胞将有可能对 HD 病变段的病理变化 进行改造，有利于神经干细胞生长，发育。通过探索影响神经干细胞移植，生长，分化 的分子机制，结合基因工程技术，将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。 鉴于神经干细胞的多向分化潜能，在大脑，脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发 现，自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出[4] （此将为神经干细胞自体移植 提供一个很好的来源），以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗 的载体细胞[5]，针对上面的问题我们提出如下假说：如同神经干细胞移植在恢复受损大脑， 脊髓神经功能上具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法修饰后，神经干细胞移植 有恢复 HD 病变肠段的正常神经支配的可能。 细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞 多取自胚胎，这样一方面细胞来源有限，另一方面存在异体免疫排斥作用。神经干细胞 可以在体外大量增殖，但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布，这样造 成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞 （mesenchymal stem cell, MSC）。前者的移植已成功用于临床治疗白血病，但其移植需 要获得足够数量的造血干细胞，并且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC 易于从骨髓中分 离，体外扩增简单，长期培养过程中能保持多向分化潜能。近期美国学者 Woodbury 等在 —3-2—
体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓MSC转化为神经干细胞,并进而分化为神经 元。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题,为今后神经干细移植治疗多 种神经系统疾病打下了基础。 总之,随着当今干细胞研究的深入,探索通过MSC转化为神经干细胞恢复小儿外 科常见疾病(先天性巨结肠症)正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性 美国《时代》周刊曾将人类胚胎干细胞(ES细胞)和胚胎生殖细胞(EG细胞)建系 研究成功列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成 为新世纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人们对ES细胞,骨髓干细胞,神经 干细胞定向分化的研究。将MSC,神经干细胞定向分化,移植的研究引入到HD这一小儿 外科常见病的治疗研究中,探索MSC,神经干细胞克隆、定向分化、移植对于HD治疗 方法,可为发育生物学积累宝贵的资料:采用细胞工程原理和方法,通过MC,神经干 细胞移植重建HD病变段的正常神经支配方法的研究成功,在临床上将可以让HD患儿 免于手术,使HD的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的健康成长做出 巨大贡献,并能带动本地区整个小儿外科水平的发展,提高本地区小儿外科在国内及国 际上的地位,为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量 参考文献 (1)陈雷玲,胡廷泽,朗诗明,等。320例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医 科大学学报,2000,31(2):27427 (2)Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons Lancet,2000,355(9218):1890 (3)McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3) 233-249 (4) Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Devel opment,1999,126:157-168 )刘平,卢亦成,朱诚。中枢神经干细胞。中华神经外科杂志。200016(3):196-198 (6)Woodbury D, Schwarz e, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370 3-3
体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓 MSC 转化为神经干细胞, 并进而分化为神经 元[6]。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多 种神经系统疾病打下了基础。 总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通过 MSC 转化为神经干细胞恢复小儿外 科常见疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性。 美国«时代»周刊曾将人类胚胎干细胞（ES 细胞）和胚胎生殖细胞（EG细胞）建系 研究成功列为 20 世纪末世界十大科技成就之首，并认为 ES 细胞和人类基因组将同时成 为新世纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人们对 ES 细胞，骨髓干细胞，神经 干细胞定向分化的研究。将 MSC,神经干细胞定向分化，移植的研究引入到 HD 这一小儿 外科常见病的治疗研究中，探索 MSC，神经干细胞克隆、定向分化、移植对于 HD 治疗 方法，可为发育生物学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方法，通过 MSC，神经干 细胞移植重建 HD 病变段的正常神经支配方法的研究成功，在临床上将可以让 HD 患儿 免于手术，使 HD 的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的健康成长做出 巨大贡献，并能带动本地区整个小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在国内及国 际上的地位，为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量。 参考文献 (1) 陈雷玲，胡廷泽，朗诗明，等。320 例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医 科大学学报，2000，31(2)：274-27 (2) Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890 (3) McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3): 233-249 (4) Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157-168 (5) 刘平，卢亦成，朱诚。中枢神经干细胞。中华神经外科杂志。2000，16（3）：196-198 (6) Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370 —3-3—
研究方案 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标 探索建立针对先天性巨结肠症的MSC,神经干细胞移植治疗方法。 研究内容: 1.MSC的分离,体外克隆 2.MSC向神经干细胞的转化 3.多种人工修饰条件下的神经干细胞在HD动物模型( lethal spotted rat, Is/ls)无神 经节细胞肠段移植,定向分化: 4.鉴定神经干细胞移植后HD动物模型的消化道神经系统形态及机能。 拟解决的关键问题 1.MSC向神经干细胞的转化 2.神经干细胞的基因修饰: 3.神经干细胞移植,定向分化的分子机制
三、研究方案 1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标： 探索建立针对先天性巨结肠症的 MSC，神经干细胞移植治疗方法。 研究内容： １．MSC 的分离，体外克隆； ２．MSC 向神经干细胞的转化； ３．多种人工修饰条件下的神经干细胞在 HD 动物模型（lethal spotted rat, ls/ls）无神 经节细胞肠段移植，定向分化； ４．鉴定神经干细胞移植后 HD 动物模型的消化道神经系统形态及机能。 拟解决的关键问题： １．MSC 向神经干细胞的转化； ２．神经干细胞的基因修饰； ３．神经干细胞移植，定向分化的分子机制。 －4－