2.2细胞破碎和蛋白质溶解 经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成:清洗 组织或细胞;裂解细胞;离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质 (目的蛋白是膜蛋白时用去垢剂处理);通过离心、层析、电泳等 方法进一步纯化,得到产物蛋白。 细胞破碎前,组织一般用缓冲盐液洗去残留血液和污染物 培养细胞通常用缓冲盐液混悬后离心,除去残留培养液等。细胞 破碎获得的抽提物称为匀浆。匀浆根据不同需要可以在 12000×g离心10min到100000×g离心1h范围内离心。沉淀 主要含有膜组分等,弃去。上清含有目的蛋白称为粗提物。如果 粗提物有漂浮颗粒,可用纱布或玻璃纤维滤去后再进一步纯化。 各种组织和细胞的常用裂解方法列于表2.l 表2.1各种组织细胞破碎方法 细删破碎方法 组织种类 旋刀式勾浆 大多数动、植物组织 手动式匀浆 柔软的动物组织 超声 细胞混悬液 高压匀浆 细酉、酵母、植物细胞 研磨 细茵、植物细胞 高速珠磨 细胞混悬液 酶溶 细菌、酵母 去垢剂渗透 组织培养细胞 有机溶剂渗透 细荫、醇母 低渗裂解 红细胞、细菌 冻融裂解 培养细胞 2.1匀浆 匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。它的工作原理是 通过固体剪切力破碎组织和细胞,释放蛋白进入溶液。市售的匀 浆器主要有四类,刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、 玻璃匀浆器和用于规模生产的高压匀浆器。玻璃匀浆器的匀浆头
(杵)有玻璃制的,也有特夫隆制的,既可以手动也可以电 动9.23,24.28)。高压匀浆器的工作本节暂不涉及。由于匀浆过程 中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小,所以匀浆是简便、迅速和 风险小的组织破碎方法,是实验室首先考虑的方法之一。 图21匀浆器 22.1.1操作步骤 1)用组织剪或手术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块 如 2)每体积湿重组织通常加3~5倍体积预冷的匀浆缓冲液至 匀浆容器内
3)制备匀浆:①电力驱动的玻璃匀浆器以500-1500r/min 的速度,匀浆3~6次,每次5~10s。②手动玻璃匀浆器 匀浆10~20次。③刀片式组织破碎匀浆器和内切式组织 匀浆器以1000~3000r/min的速度,高速匀浆3次,每 次20~30s,次间暂停几秒。 2.2.1.2注意 1)玻璃匀浆器杵和日之间的空隙应为0.35-0.70mm。电 动玻璃匀浆器常用于匀浆肝、心、肌肉等软组织的匀浆 手动玻璃匀浆器常用于培养细胞和脑组织等的匀浆。 2)匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴, 其他匀浆容器可预冷或在冷室内匀浆。 3)匀浆时所需匀浆缓冲液的体积在不同条件下可有很大差 别,有时甚至可为湿重组织体积的9~10倍。 )匀浆的效果可以用相差显微镜观察组织细胞状况评估, 也可定量单位湿重组织释放的蛋白质含量监控。 2.2.2超声 输入高能超声波可以破碎细胞,其机理可能与强声波作用溶 液时,气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的 冲击波和剪切力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声 能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。 使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度,即刚好低 于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性。过低 的强度将降低破碎效率。最好在正式实验前用多余样品试超,调 校超声波发生器在稍低于产生泡沫的强度。正式超声样品时强度 只能在预定位置附近做微小调整 超声破碎在处理少量样品时操作简便,液量损失少,适于实 验室应用。但是超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质 变性失活,噪声令人难以忍受,大容量装置声能传递、散热均有
困难。 图2,2超声波细胞裂解仪 2.22.1操作步骤 1)清洗后的组织用搅切机切碎成小块,混悬在至少两倍体 积的缓冲液内;洗去培养液的细胞(细菌),混悬在至少 两倍体积的缓冲液内; 2)将超声探头没人混悬液内,进行超声破碎。一般总超声 时间约2min,分为几个周期,如4×30s,周期之间让样 品在冰浴中冷却。 2.2.2.2注意 1)超声破碎常用于多种细菌和脑组织匀浆。根据具体情况 可以适当延长破碎时间,一般不宜超过10min,但最多 处理1g细菌或组织。 24
2)用相差显微镜检查细胞破碎的效率。 3)超声破碎需提醒注意的一点是在整个过程中探头要保持 低于混悬液表面。 4)具体细节可参阅文献[7,13,29]介绍的实例。 2.2.3高压匀浆 细胞悬液从高压室的环状隙高速 喷射到静止的撞击环上,被迫改变方 向经出口管流出。此过程中细胞经历 了高速造成的剪切、碰撞及高压到常 压的变化,从而破碎释放内含物。增 加压力或增加破碎次数都能提高破碎 效率,但压力增加到一定程度零部件 磨损较大。通常撞击环较易磨损应定 期更换。为防止污染,使用前后高压 室至出口管需彻底清洁。 2.2.3.1操作步骤 1)用裂解缓冲液混悬清洗过的图23高压匀浆器 细胞。通常细胞湿重(g)与 缓冲液体积(ml)之比的范围是1/1到l/4 2)加样品液进入高压室,并提升压力至预定值(一般 0.55×108~1.38×108Pa; 3)维持上述压力,调整出口流速为每分钟2~3ml(约每秒 1滴)。 2.2.3.2注意 )该法常用来裂解细菌和酵母3 2)适用于中等体积(10~30ml)的样品,体积太大或太小 均不适宜