3)为获得样品最佳破碎效果,样品可以第二次甚至第三次 通过高压匀浆。 4)温度敏感物质有必要低温操作。多次实施时,每次样品 要冷却 2.2.4研磨 研磨是破碎单一细胞的有效措施。借助研磨中磨料和细胞间 的剪切及碰撞作用破碎细胞。常 用的磨料为沙子、氧化铝8:41。 在研钵内样品与磨料被研磨成厚 糊状。一次破碎的细胞量湿重可 达30g 224.1操作步骤 1)加20g清洗过的细胞入预 冷的研钵内; 2)准备40g石英沙或氧化 铝; 3)在研磨细胞的过程中逐步 加入石英沙或氧化铝,即 图24高遠珠磨匀浆备 边研磨边加入。加完磨料 再继续研磨几分钟; 4)用60ml缓冲液混悬细胞糊,离心除去细胞碎片和磨料。 22.4.2注意 1)此法主要用于细菌、酵母和一些植物组织。研磨操作 般不超过15mino 2)石英沙或氧化铝用前做清洁处理。 3)研磨时产生劈啪声可能是效果不错的好兆头
2.2.5(高速)珠磨 该法应视为研磨法的扩展。它用玻璃珠替代磨料。小量样品 (湿重不超过3g)可在试管内进行,大量样品需使用特制的高速 珠机。 2.25.1操作步骤 1)0.1-3g湿重细胞混悬在等体积缓冲液内。容器建议选 用结实的聚乙烯试管; 2)每克湿重细胞加入1~3g预冷的玻璃珠; 3)用混旋搅拌器最大强度混旋3~5次,每次lmin,两次 之间置冰上冷却1min 2.2.5.2注意 1)本法最常用来破碎酵母。 2)玻璃珠直径500mm,用前如下处理:浓盐酸洗后,双蒸 水洗至中性,烘十用前预冷。 3)混旋时易漏出,宜用饣密封圈的螺旋盖关紧试管或用石 蜡膜封好 2.2.6酶溶 酶浴法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。因 此利用此方法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当 的酶。常用的有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶 蚩白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等。细菌主 要用溶菌酶处理,酵母諾邗几种进行复合处理。使用溶酶系统 时要注意控制温度、酸碱度、酶用早、先后次序及时间。这里仅 以溶莴酶处理大肠杆菌为例.介绍具体方法如下
226.1操作步骤 1)混悬洗过的大肠杆菌于TE缓冲液内,每克细菌需3ml 缓冲液。调整温度至20℃-37℃ 2)每5ml混悬液加人1mg溶菌酶,可以从新配制10mg/ml 的母液吸取或直接用酶的冻干粉 3)在20℃~37℃温育10~20min,同时轻轻摇动。 22.6.2注意 1)增加溶菌酶的浓度,如高达10mg/m,能更快的溶解细 菌,用更高的浓度甚至在4℃作用5min即可获得满意的 溶解。 2)虽然酶溶法有选择性释放产物、核酸泄出量少、细胞外 形完整等优点,但它也存在明显不足:如酶价格高、通 用性差、有时存在产物抑制。 3)酵母细胞酶溶法较复杂,其操作步骤可查阅文 献[12,16 2.2.7化学渗透 有些有机溶剂(如苯、甲苯)6、抗生素、表面活性剂 (SDS、 Triton X-100)、金属鳌合剂(EDTA)、变性剂(盐酸胍 脲)等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性,使内含物有选 择地渗透出来。这种处理方式就是化学渗透法。本文仅以表面活 性剂 Triton x-100为例简要介绍如下。 2.271操作步骤 )用缓冲盐液(TBS:10 mmol/ pH7.5 Tris-HCl, 150 mmol/L NaC)4℃洗细胞几次; 2)离心除去缓冲盐液,在含0.1%~0.3% Triton X100的 缓冲盐液(TBS)中混悬细胞(107~105细胞/nl或总
蛋白3~4mg/ml); 3)混旋或颠倒试管几次后,冰浴中孵育10-60min 2.2.7.2注意 1)低浓度表面活性剂处理、如能充分溶解细胞,则它是很 温和的方法 2)若目的蛋白不稳定,冰浴中孵育时间可以减少甚至取消; 裂解液内加人0.2倍体积50%甘油也可以稳定目的蛋 白 3) Triton x100以外的表面活性剂也可以用。 4)此法主要用溶解培养的动物细胞| 2.2.8其他方法 其他较常见的还有低渗裂解法、冻融裂解法等。低渗裂解法 是无胞壁细孢在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法,常用 于红细胞的裂解。冻融裂解法是反复冻融几次裂解细胞的方法, 它仅适用于提取非常稳定的蛋。对于韧性很强的组织如皮肤 肌腱等,可用液氮冻硬变脆、敲碎成小块后,在硏钵中加液氮研 成粉再加缓冲液溶解。上述方法的细节就不再赘述了,如感兴趣 可査阅其他参考书及文献。 2.3包涵体蛋白质的溶解 采用分子生物学技术导入的外源基因在细菌中获得外源蛋白 的高效表达,常常造成相当多的蛋白质产物在细菌内凝集为没有 活性的固体颗粒,即包涵体42。包涵体基本由蛋白质构成, 其中50%以上是克隆产物,这些产物的一级结构是完全正确的, 但是立体构型却存在错误,所以没有生物学活性。天然细菌蛋白 很高水平表达时也有凝集的倾向.尤其是单个氨基酸残基突变的 大然蛋出可能形成包涵体.溶解包涵体,使其中的蛋白产 物恢复活性是相当困难的。这就促使科学家一方面探讨在表达中
避免蛋白产物包涵体的形成;另一方面研究从包涵体分离出有活 性的蛋白产物。分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤如下:破碎 细胞→分离包涵体→溶解包涵体→蛋白质产物的构型复原等。 2.3.1包涵体蛋白质的溶解及复性 包涵体形成的原因比较复杂,至今尚不完全清楚。研究表明 它的形成并非由于表达蛋白浓度超过溶解度造成的,链内二硫键 的错配也不是它形成的主要原因17.2.3)。优势的观点认为:表 达的外源蛋白缺少某些协助因子或因为局部微环境不适宜,不能 正确地连续地形成次级键,经过多个中间折叠体最终形成天然三 维结构。包涵体很可能就是表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度 积聚在一起形成的不溶物。它们不能进一步完成正确折叠成为天 然结构,而是表达蛋白非天然形式的混合物02包涵体有 时在相差显微镜下可以直接观察到,位于大肠杆菌两端,呈深色 的折光点,约0.5~1pm。电镜易于观察和鉴定。 虽然包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物,但是其肽链本 身是完整的,或者说一级结构是正确的。从包涵体纯化表达蛋白 的一个优点是包涵体易于与细胞其他成分分离25)。一般的水溶 液很难溶解包涵体,只有在变性剂(如盐酸胍、脲)溶液中才能 很好溶解。这时,溶解的包涵体蛋白获得完全变性,即除一级结 构和共价键保留外,所有的氢键、疏水键全被破坏,疏水侧链完 全暴露。然后,在一定条件下除去变性剂促使产物蛋白完成正确 的蛋白折叠过程,获得天然结构,该过程称为复性。蛋白质复性 是十分复杂的过程,目前采用的方法主要有两种。一种是稀释溶 液,使溶液中变性剂浓度逐步降低,蛋白质开始复性。此法简单 易行,但操作的液量体积有时过大,同时也降低了蛋白质的浓 度。另一种是透析、超滤或电渗析除去变性剂。透析法经常用于 实验室,溶液对水或缓冲液透析,变性剂透过膜扩散浓度逐渐降 低,蛋白质获得复性。该法液量总体积和蛋白质浓度变动不大, 但时间较长,有时会形成蛋白质沉淀