冻溶所引起的蛋白质损害。 4)最后的办法是将蛋白质以冻干的粉末保存。对许多蛋白 质而言,冻干是长期储存最安全和最有效的办法,但是 对极少数蛋白质来说一个明显的缺点是失活和不能再溶 解。因此,在将所有的蛋白质以此方法储存之前必须取 少量的进行试验。 5)通常,甘油可有效的提高蛋白的稳定性。先配置成50% 的甘油储存液,工作液中含20%~30%的甘油不会引起 操作困难[9。在蛋白溶液中加入甘油可使溶液在低温非 冷冻状态下保存。 7蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶,这些蛋白酶需 要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中 需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的 蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点,因为各种蛋白酶对不同蛋 白质的敏感性各不相同,因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于 蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低,尤其应注意在缓冲液中加 入蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝 灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 1.7.1常用抑制剂 1.7.1.1PMsF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶,凝血 酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年 4)工作浓度:17~174gml(0.1-1.0mmoL) 5)在水液体溶液中不稳定,必须在每一分离和纯化步骤中 加人新鲜的 PMSF
1.7.1.2 EDTA )抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5m1水溶液,pH8~9; 3)溶液在4℃稳定六个月以上; 4)工作浓度:0.5~1.5 mmo/L(0.2~0.5rg/ml) 5)加入NaOH调节溶液的pH值,否则EDA不溶解。 1.7.13胃蛋白抑制剂( pepstatin) 1)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶,血管紧张肽原酶,组织蛋 白酶D和凝乳酶; 2)lmg/ml溶于甲醇中 3)储存液在4℃一周内稳定,-20℃稳定6个月 4)工作浓度:0.7gml(1pmoL) 5)在水中不溶解 1.714亮抑蛋白酶肽( leupeptin) 1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶,如木瓜蛋白酶,血浆酶和组 织蛋白酶B; 2)10mgml溶于水; 3)储存液4℃稳定一,-20℃稳定6个月; 4)工作浓度0.5mg/ml 1.7.15胰蛋白酶抑制剂( aprotinin) 1)抑制丝氨酸蛋白酶,如血浆酶,血管舒缓素,胰蛋白酶 和胰凝乳蛋白酶; 2)10mgml溶于水,pH7-8; 3)储存液4℃稳定-周,-20℃稳定6个月 4)工作浓度:0.06-2.0g/ml(0.01-0.3ymoL); 5)避免反复冻融;
6)在pH>12.8时失活。 1.7.2蛋白酶抑制剂混合使用 35pg/ ml PMSF……丝氨酸蛋白酶抑制剂 0.3 mg/ml EDtA…………金属蛋白酶抑制剂 07gm胃蛋白酶以致剂( Pepstatin)…酸性蛋白酶抑制 剂 05g/l亮抑蛋白酶肽( Leupeptin)…广谱蛋白酶抑制剂 参考文蔽 LIl Blanchard, J. S. 1984. Buffers for Enzymes. Meth. Enzymol., 104: 404-41 [2] Keesey,J. ed. 1987. Boehringer Mannheim Catalog: Biochemica Information Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis [3]Bordier, C. 1981. Phase Separation of Integral Membrane Proteins in Triton X-114 Solution. J. Biol. Chem, 256: 1604-1607 [4] Gueffroy, D. E. ed. 1975. Calbiochem Buffers: A Guide for the Preparation and Jse of Buffets in Biological Systems [5]Calbiochem Biochemical/Immunochemical Catalog. 1989 [6] Elis, K. J. and J. F. Morrison. 1982. Buffers of Constant lonic Strength for Studying pH-Dependent Processes. Meth. Enzyrmol. 87: 405-426 [7] Fink. A. L. and M. A. Geeves. 1979. Cryoenzymology: The study of Enzyme Catalysis at Subzero Temperatures. Meth. Enzymol. 63: 336-370 [8] Ganzi, G.C. 1984. Preparation of High-Purity Laboratory Water. Meth. Enzy mol104:391-403 [9]Good, N. E, G.D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Lawa and R M.M. Singh. 1966. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochem. 5: 467~477 [10]Grady, J. K, N. D. Chasteen and D. C. Harris. 19 Radi from Good'"Buffers. Anal. Biochem. 173: 111-115. [11] Harlow, E. and D. Lane. 1988. Antibodies: A Laboratory Mannal. New York Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hard [12] Helenius, A. and K. Simons. [975. Solubilization of Memranes by Detergents Biochim. Biophys. Acta 415: 29-79 [13] hjelmeland, L. M. and A. Chrambach. 1984. Solubilization of Functional Men
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第二章蛋白质的提取和溶解 为了纯化细胞蛋白质,采用有效的方法进行细胞破碎和固液 分离是必要的。它是全过程的第一步,通常是将处于细胞不同位 置的待纯化蛋白释放出来,溶人已知成分的溶液内。该步骤是目 的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节,它直接影响产物的回收 率,也可能影响产物的纯度 目前已建立很多破碎细胞,释放细胞内容物的方法。根据作 用方式不同,基本可以分为两大类;机械法和非机械法。传统的 机械法包括匀浆、研磨、压榨、超声等;常见的非机械法包括渗 透、酶溶、冻融、化学等;其中一些新的方法也在不断发展和完 善,如激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等2)。每一种方法都 有它的适用范围及优缺点,选择的标准常常要依靠过去经验和实 践比较。选择的原则是该方法不影响目的蛋白或产物的结构和功 能,或者说,采用的方法可以避免造成目的蛋白或产物的变性或 失活。常见组织和细胞的破碎和溶解一般都采用传统的标准方 法,有时为了增加活性蛋白的回收率或针对产物蛋白的特性尝试 或筛选细胞破碎和溶解的方法也很有必要。此类方法的原理和细 节可以参阅1990年出版的酶学方法(英文)182卷。 有时细胞破碎后,某些蛋白质并不能被释放进人溶液,例如 在细菌中形成的包涵体蛋白。包涵体通常由于诱导细菌高水平表 达单一蛋白,造成不溶性积聚而产生。纯化包涵体蛋白必须在细 胞破碎后,将其转变成可溶形式,在纯化前或纯化过程中还需恢 复目的蛋白的活性。基本策略和方法本章将做介绍