1.5.1.1离子型去垢剂 离子型去垢剂包括一个带电荷的头部,带阳离子电荷的为阳 离子去垢剂,带阴离子电荷的为阴离子去垢剂。这一类型去垢剂 的缺点是使蛋白质高度变性,但是使用这种类型的去垢剂可使蛋 白以单体的形式被分离,对于测定蛋白的分子量较为方便。 (!)十二烷基硫酸钠(Sls)或十:烷基硫酸锂(LiD￡S) 这两种阴离子型去垢剂,L)S的优点为在4℃可溶解 而SDS则不溶。要使lng的膜蛋白完全溶解,需要用 10mg或更多的Ls2。值得注意的是在含钾离予的缓 冲液和硫酸铵的缓冲液中使用这种去垢剂在室温下易发 生沉淀。溶液中盐离子的浓度订明显的影响去垢剂的临 界胶束浓度(CMC),如SDS,当Na】浓度在0 0.5moA.时,其CMC值则从8 mmol/降至0.5 V/L 14] (2)胆酸钠和脱氧胆酸钠 胆酸钠和脱氧胆酸钠为阴离子型去垢剂,与其他离型 去垢剂相比其对蛋白质的变性作用较弱。去垢剂浓 度高于临界胶束浓度(CMC)可以形成两类分子团 初级胶束(包括9个分子)和二级胶束(包括9-60个 分子)。与其他去垢剂不同的是,在CMC值以上、游 离的胆酸盐和脱氧胆酸盐单体分子可累积,这类去垢剂 分子的pK,值为8-9,在p低于7.5时,去垢剂分子 的酸性形式将发生沉淀。二价的阳离子也可使脱氧胆酸 钠的沉淀 15.12非离子型去垢剂 非离子型的去垢剂带有非极性的亲水头部,对蛋白和蛋白间 的相互作用干扰较弱,对于分离功能性的蛋白复合物较为有利。 与离子型去垢剂相比其对蛋白的变性作用较弱,然而在这种去垢
剂中蛋白易发生聚集。 (1)Triton X-100 在1%~3%浓度的 Triton X100下许多蛋白质活性保 持不变。对于膜脂蛋白须用10倍或更高浓度的 Triton X-100来溶解。 Triton x100在280nm处有强的吸收 值。 (2)Triton X-114 温度在20℃以上时蛋白质溶液中加入2%的 Triton x 114可使蛋质从去垢剂相和液相中分离,可溶性的蛋 白质仍在液相中,而膜蛋白则进入去垢剂相中31。 (3)NP40 NP40在280mm处有弱的吸收值,在蛋白分离中使用 较方便。 (4)辛葡糖苷( Octylglucoside,OG) 与 Triton X100相比OG具有很多的优点,20 45mmol/LOG即足够用来溶解膜蛋白,OG具有高的 CMC浓度,因此和 Triton相比很容易从溶液中去除。 5) Tween-20 tWeen.20通常在固相免疫细胞化学反应(ELSA, RIA,免疫印迹)中用来阻断菲特异性蛋白质的相互作 用。 Tween20具有低的CMC值 15.13两性去垢剂 两性去垢剂带有正、负离子的头部,与非离子去垢剂相比可 减少蛋白质和蛋白质间互相作用的干扰及离子型去垢剂使蛋白质 变性的作用。 1) CHAPS: CHAPS不干扰离子交换色谱和等点聚焦电泳 含 CHAPS的蛋白溶液可以冻存。 2) Zwittergent3-l4
1.5.2蛋白质溶解的初始操作步骤 1.5.2.1实验步骤3 准备细胞膜的粗提成分,在蛋白质浓度为0mgml的 50mm/缓冲液中,加入0.15 mol/ Kcl,4℃保存 2)用同样的缓冲液配制去垢剂储存液(10%,w); 3)分别在含001%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、3%去 垢剂的缓冲液中稀释细胞膜的粗提物,使其浓度约为 5mg/ml 4)4℃震摇h(避免气泡产生); 5)4℃100000×g离心Ih 6)吸弃上清,加入同体积、同浓度的含去垢剂的缓冲液; 7)每一步需测定蛋白质浓度(见第三章); 8)每一步需测定酶活性。 1.52.2一般规则 )最合适的使蛋白质溶解和保持蛋白质活性的去垢剂浓度 可在后续的实验中继续使用。如果用不同的去垢剂均不 能获得较好的结果,可探索将多种去垢剂混合使用。若 蛋白的活性很低,可在溶液中加人20%~50%v/v的甘 油保护。还需加入还原剂( Ammo/L DTi或5mml 二巯基乙醇),螯合剂(1mmo] L EDTA)或蛋白酶抑制 剂(75g/ mI PMfs,20mg/ ' ml leupeptin或 pepstatin;见 1.7)。 2)有些时候,蛋白质如果在KCl溶液中不溶解,往往可溶 于0.1~0.2m仉L的磷酸盐溶液中。 3)蛋白的溶解般发生在去垢剂的浓度达到CMC值时13 4)1981年 Bordier使用了非离子去垢剂 Triton x-114在分 离膜蛋白的第一步中(这一步可迅速的分离膜蛋白以避 免溶酶体蛋白酶的作用),然后通过离子交换色谱可去除
去垢剂。 5)在高盐(0.15~2 mmol/L Ko),高或低的pH值,以及 高浓度的螯合剂(10mmol/ L EDTA或EGTA),或变性 剂如尿素或6~10moL的盐酸胍可破坏膜制品中的膜 蛋白和膜之间的相互作用 6)对可溶性蛋白的定义还不是很清楚,由于受溶解度及温 度的影响,有些蛋白质经过105000×g离心Ih后,仍 可留在上清中。这时可试用凝胶过滤层析法分离{13 1.6蛋白质的环境因素 16.1表面效应 蛋白质的稀溶液经常迅速的失活,可能是由于玻璃容器的 表面使蛋白质变性的结果。这一作用可在溶液中加人高浓度其他 蛋白如牛血清白蛋白(BSA)来防止。在理想情况下,为了避免 加入“污染”蛋白,应将稀释后的蛋白溶液立即浓缩。然而,酶 的反应通常是在较低的浓度1四gml下进行,因而加人BSA是十 分必要的。另外,由于玻璃表面的非特异性吸附可损失大量的纯 化蛋白(5cm2的玻璃表面可吸附lpg的蛋白),在溶液中加入 BSA时可大大降低这一作用。通常在酶活性测定中至少加人 01 mg/ml BSA,而蛋白质储存液中则可加入l0mgml BSA [19 1.6.2温度 尽管有些“不耐低温的酶”(如线粒体ATP酶)在低温下易 失活,但大多数的酶在温度升高10℃(如从18℃升至28℃时) 酶反应速度会增加一倍。超过30℃-40℃,蛋白质极不稳定, 大多数蛋白质失活,但是一些蛋白质甚至在煮沸下仍有活性(如 细菌碱性磷酸酶)
1.6.3储存 作为一个原则,蛋白质的半衰期在低温下可延长。通常要依 据蛋白的用途来决定其储存条件是在4℃、-20℃、-80℃或液 氮(-200℃)下。 短期储存时(从…天至一-周),蛋白溶液在以下情况可储存 于4℃。①蛋白质的活性功能(如酶活性,配体结合等)在这 时期内不降低。②在双相电泳中未见蛋白质降解。③在 20000×g离心10mn未见明显的沉淀(沉淀的出现意味着蛋白 质的变性)。 长期储存时(超过一周),要根据不同蛋白质的稳定性来选 择合适的方法。在确定某种方法大量保存某种蛋白质之前,应当 实验以下几种不同的方法 1)一种最简单的方法是在硫酸铵溶液中将沉淀以悬浮形式 保存于4℃。 2)另一种方法,硫酸铵沉淀蛋白质后2000×g离心 20min,在液氮中冷冻然后储存于-80℃或更低的温度 下 3)如果想冻存蛋白质,必须按照以下的操作以最大限度的 减少蛋白质溶液中各相的分离以避免沉淀的发生或局部 缓冲液浓度的增高而引起pH值在±3个单位中的波动。 高浓度的蛋白(2mg/ml)可提供自我缓冲作用,在液氮 中冷冻蛋白可减少冻结所需的时间1。在液氮中冷冻蛋 白质的合适的方法是用巴斯德滴管或自动加样枪将50l 的蛋白质液体小滴滴入液氮中。滴入的速度要慢,以防 止蛋白质溶液未形成小滴。对大体积的蛋白质溶液的冷 冻,可使用 peristalic泵或自动滴液器来操作。在完成 后,从液氮中将这些沉淀舀出迅速放入储存管中以防液 滴的溶解,然后将其储存于-80℃或液氮中。在实验中 可方便的倒出所需用量的蛋白质液滴从而避免多次反复 15