1.24某些缓冲液使用时的注意事项 在蛋白溶液的所有成分中缓冲液往往以最高浓度存在,这样 就对蛋白质或酶的活性有显著的影响。缓冲液中的无机成分(磷 酸盐,硼酸盐,碳酸盐)可以与酶或其底物反应,从而影响酶的 活性。更为严重的是一些缓冲液可与二价或三价金属离子形成配 位复合物,释放出质子,降低了溶液的pH值;或螯合金属离子 产生不溶性复合物。因此,在研究一些具有金属离子要求的酶 时,需采用与金属结合力低的缓冲液,如 PIPES,TES,HPES 和CAPS等。以下介绍几种常用缓冲剂的性质: I)磷酸盐:①在pH8~11范围内适用;②可与多价阳离子 结合形成沉淀;③抑制多数酶的活性,包括激酶、磷酸 化酶、脱氢酶和以磷酸酯为底物的酶1);④溶液的pK 值随缓冲液的稀释而变。 2)柠檬酸盐可与一些蛋白结合并形成金属复合物9。 3)二甲胂酸盐有毒性19 4)碳酸盐溶解度较低,由于CO2影响其酸碱平衡,因此应 在密闭系统中操作。 5)ADA在波长为260m有吸收值,并可结合金属离子。 6)MOPS干扰 Lowry法蛋白定量,但却不影响 Braford或 Bicinchoninic Acid法蛋白定量(见第三章) 7) Hepes;①干扰 Lowry法蛋白定量,但却不影响 Braford 或 Bicinchoninic Acid法蛋白定量(见第三章);②由于带 有哌嗪基的缓冲液(如 Hepes,EPPS9)在多数情况下 可形成自由基团,因而在氧化还原反应中应避免使用这 些溶液[10。 8)Tris:①在pH70以下缓冲能力弱:②具有一个可能引 起反应的伯胺基团;③参与多种酶反应例如可被碱性磷 酸酶催化;④可穿过生物膜;⑤受缓冲液的浓度和使用 温度影响
9)硼酸盐可与单糖、多糖、核酸、嘌呤核苷酸以及甘油形 成复合物。 2.5防止缓冲液受污染 1)磷酸盐缓冲液很容易受微生物污染,然而,1τw冮L的磷 酸盐溶液却不易被细菌污染8。 2)无菌过滤可有效的防止细菌和真菌的污染,尤其在 pH6~8时l 3)为了防止储存缓冲液的污染,可加入0.02%(3mmdL) 的叠氮化钠,这-浓度下通常不会于扰蛋白的活性。 4)将缓冲液放在冰箱里保存订有效的减少细菌的污染。 1.2.6水的纯度 在所有实验使用的每一种溶液中,水是最重要的成分。在蒸 馏及去离子过程中可去除许多杂质成分,但仍可能有痕量的杂质 存在并影响蛋白溶液。因而在实验研究中需要利用高纯度水处理 系统进行水的纯化N。 3盐、金属离子和螯合剂 1.3.1离子强度 通常用0.1~0.2 mol/L KCI或NaCl来模拟生理状况下的离 了强度10 1.3.2二价阳离子 如果缓冲液和二价阳离子如(a2或Mg之间形成复合物, 则缓冲液对氢离子的缓冲能力将明显的降低。另外,金属离子的 沉淀可丧失酶反应的活性,因此应当注意缓冲液对金属离子的亲 和性。 1)如果蛋白质的活性或稳定性需要金属离子维持,这时应 避免使用Tris缓冲液。在100 mmol/L Tris缓冲液中加入
2 mmol/ mn2则29%的金属离子被鳌合 2)为了使实验具有可重复性,在操作ATP结合酶时,加入 Mg2+使其浓度超过ATP浓度可确保所有的ATP呈现 Mg. ATP形式23 1.3.3螯合剂 为了避免金属离子的干扰,应在溶液中加人特异金属离子的 螯合剂。但应注意金属离子螯合剂同时能使金属蛋白酶失活。 1)为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子,可在其中加 入0.1~5mmo的FDTA9。 2)最常用的金属离子螯合剂为EDTA和EGTA。FDTA对 大多数金属离子有非特异的亲和性;而EGTA对Ca2+有 很强的亲和性,明显高于对Mg2+的亲和力,使用EG TA可有效的去除溶液中的Ca2+。 3)邻二氮杂菲( o-phenanthroline),可鳌合Zn2,而间-邻 二氮杂菲( m-phenanthroline)则不行22 1.4还原剂 1.4.1总则 在细胞中有许多种还原成分,如谷氨酰胺可防止蛋白质氧 化。但是一旦细胞破碎,由于和氧的接触以及稀释作用而引起抗 氧化成分的减少,使许多蛋白质被氧化而失去活性,尽管有时可 通过减少巯基的存在使其恢复活性。但.价阳离子的存在仍可加 速硫键的形成9 1.4.2特殊情况 1)常用的二巯基乙醇以溶液状态储仔在4℃`,其使用浓度 应为5·20mm/在加入缓冲液中24h内,∷巯基乙 醇被氧化,其后可加速蛋臼的失活(。 2)DTT也被广泛使用,储存液必须置于-20℃,DTT使
用浓度为05~1.0mmoL,因氧化而形成稳定的分子 内二硫键,并不危及蛋白质的巯基。 3)一个好的策略是在蛋白质制备过程中用1:1000稀释的 巯基乙醇(浓度大约12mmol/L),而在长期储存时加人 1-5 mmo/L DtT9。 4)注意有些酶对还原作用很敏感!81。 1.5去垢剂 在膜蛋白的提取和纯化过程中常用去垢剂,在去垢剂的帮助 下使膜蛋白溶解。本节涉及了去垢剂的分类及不同种类去垢剂对 膜蛋白的溶解和稳定作用。 去垢剂为双极性分子,可在水中溶解。除了胆酸盐以外,去 垢剂分子通常是由线形或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不 相同的亲水性头部组成。去垢剂的一个重要的特性是可以形成分 子团结构,成簇的去垢剂分子将亲水性的头部向外。溶解的膜蛋 白与去垢剂分子结合成团,膜蛋白的硫水区或穿膜区被去垢剂分 子覆盖,使其能与水性缓冲液相溶。去垢剂的临界胶束浓度 (CMC)是去垢剂与膜蛋白结合形成微胶粒时去垢剂的最低浓 度。高CMC值的去垢剂在稀释时可形成单体分子,这样可通过 透析迅速的去除去垢剂分子。另外,去垢剂形成的微胶粒的分子 量对于透析,凝胶过滤色谱及非变性电泳都是非常重要的。温 度、pH值、离子强度、多价金属离子的存在,以及有机溶剂和 去垢剂的纯度均可影响去垢剂的CMC值。 尽管高浓度的去垢剂往件引起蛋白的变性,但是在去除去垢 剂后可使蛋白质复性,为了避免蛋白质变性,可使用浓度低于 01%的非离子型去垢剂° 15.1去垢剂的分类 表1.2为去垢剂的特性
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