第一章蛋白质分离的准备 本书是关于蛋白质分析和分离的实验室技术操作手册。蛋白 质是一种极具多相性的生物大分子,离开其天然环境,蛋白质分 子极不稳定,在细胞中和抽提液中蛋质的性状也不尽相同。蛋 白质有多种类型,通过不同的方法我们可区分可溶性蛋白、膜结 合蛋白、具有催化功能的蛋白或结构蛋白及转录调节蛋白 从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如 果不能满足这一条件,蛋白将很快的失去生物学活性,其生物半 衰期也将迅速降低。因此,在蛋白质的特性研究中,确定提取条 件是一个关键问题。在不同的实验中所遇到的困难各不相同,有 的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定,在 有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同的实验中要针对 不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着 些共同的参数。在本章中我们来讨论这些参数并希望能给蛋白质 实验研究工作提供一些总体的线索和方法。 1.2缓冲液 1、2.1缓冲液的性质 缓冲液可以抗衡蛋质溶液中pH值的改变,选择合适的缓 冲液对于维持-定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十 分重要。pH和pKn是描述缓冲液的两个重要概念。pH值 是指溶液中氢离子浓度的负对数,pl=-bog(H)。pK值是 溶液中酸解离常数的负刈数值。溶液的pH值与pKa值越接近, 表明溶液的缓冲能力越强,离pK值越远则缓冲能力越弱
12.1.1选择缓冲液时要考虑的因素 1)pKa值(见表1.1) 豪11常用缀冲液的pK值 常用名 缓冲液名 pK值 磷酸盐(pK4) 2.l5 拧檬酸盐(pKa1) 3.06 甲酸盐 3.75 琥珀酸盐(pK4) 4.21 拧橄酸盐(pK2) 4.76 醋酸盐 吡啶 柠懞酸盐(pK3) 琥珀酸盐(pK2) 5.64 2-(N-吗啉)乙基磺酸 6.15 二甲胂酸盐 二甲胂酸 6.27 酸盐 6.35 BIs-Tris 双-(2-羟基乙基)亚氦棊]羟甲基钣基甲烷 6.46 (羟基甲基)甲烷 N-(2-乙酰氨基)-亚氨二乙基 6,59 PIPES 哌嗪[双]乙磺酸 6.76 H- Tris propane1,3-双[三羟甲基氨堪甲梡(羟基甲基) 甲基氨基]丙烷 ACES N-(2-乙酰氨)-2-氨乙磺酸 咪唑 MOPs 2-(N-码啉代)-丙烷砩 7.20 磷酸盐(pK2) 7.20 TES N-::(羚甲林)甲私~2-铽基乙烷磯酸 H N-2-羟乙棊哌嗪…2乙基磺酸 7.55 HePPS(EPPS) N-2矜乙基哌嗪-N·3·闪掛硫酸 8.0 三羟甲基氨基甲烷 8.06 racine N三(羟甲基)甲基甘氨酸85
续表 常用名 缓冲液名 k,值 双针氨肽 計氨酸 N.N-双(羟乙基)甘氪酸 TAPS 羟甲基屮氨基丙烷磺酸 酸盐 环已氨基乙烷磺酸 9.55 氨酸 碳酸盐(gK2) CAPS 3-(环己氨基)丙磺酸 磷酸盐(p3) 12.43 引自 Calbiachern“Buf(rs”手册或 Blanchard(94) 2)pK3值随温度而变 3)稀释后的p4值的改变 4)溶解度 5)与溶液中其他成分的相互作用(如金属离子和酶 6)价格 7)紫外吸收值 8)对生物膜的通透性 1.2.1.2一般原则 1)们条件时,应对pK,相近的…些缓冲液进行试验,以避 免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作 用 2)当选定一种缓冲液之后,一般使用其最低的浓度以避免 非特异性的离子强度的影响。通常以50mmL的缓冲 液浓度作为试验起始浓度 3)当缓冲液凼。值的变化超过1个pH单位时其有效的缓 冲能力明显降低。而许多酶在极限pH值时往往发生不 可逆的变性{21
4)大多数动物细胞在37℃的生理状况下的pH值为70~ 7.5,而在温度下降至接近0℃时可达8.019。 5)要根据所选用的分离方法选用缓冲液:凝胶过滤方法, 大多数缓冲液均可适用。阴离子交换层析,阳离子缓冲 液首选Tris缓冲液。阳离子交换和羟基磷灰石层析,阴 离子缓冲液首选磷酸盐缓冲液 6)混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范 雨(6 7)在低温时缓冲液和冰点溶剂的情况可参阅文献[7]。 8)所采用的化学试剂应达到试剂级或更高纯度。 1.2.2缓冲液配制 1)通常,应当在缓冲液所使用的温度下调节溶液的pH值, 这就要求在工作温度下,通常为4℃时校正pH电极。然 而在实际情况中,是在室温下调节缓冲液的pH值,这 时我们应当注意到温度对pH值的影响是非常大的,尤 其是Tris缓冲液,25℃时pK值为8.06,而0℃时pK 值为8.851实验中使用的溶液应当在所有的成分(如 EITA,DrT,Mg2等)均加入后再测pH值,丙为这 些成分的加入可能改变溶液的pH值。 2)除非特定情况,-般使用HCl或NaOH,KO)H来调节缓 冲液的pH值 3)在反应中如果要彻底避免…价,二价或三价的金属离子 的十扰,则用羟化四甲铵来调节缓冲液的pH值,因为 羟化四甲铵的碱性与NOH,KOH相当。 4)无论是质子化还是非质子化的缓冲液,只要有所需的向 浓度两种溶液可根据常规的培制表或在pH剂的检测下 或通过计算很容易配制成功。 例如:配制pH5.8~7.8的磷酸盐缓冲液 储存液A(0.2m1LNaH2PO4):27.6gNaH2PO4溶于LL
去离子水中 储存液B(0.2nol1l. Na,HPO4):28.4gNa2HP4溶于LL 去离子水中 xA XB XA 55 45.0 5.0 5.9 ().0 7.0 30.0 61.0 6.0 87.7 7. 33 67.0 15.0 0 6.2 8|,5 19.5 7.3 23.0 77.0 6,4 73.5 26.5 7.5 16.0 84.0 6,自 62.5 37,5 7.7 6.7 6.8 5!.0 4.0 注意:这·帥仅足预测值,在实验中须用p计检测 1.2.3浓度对缓冲液pH值的影响 1)通常我们将缓冲液配制成10×和100×的储存液,以使 储存液的体积变小,并允许加人抑閑剂(如0.02%的叠 氮化钠),抑閑剂在使用吋可进步的稀释:.以下 些缓冲液在时可出现饱和: 们),65nvJ1 iu*是: F'1F1S 2. 1a. i ,4nl:1 .自1n4 2)在稀释高浓度的储存液吋有可能会改变溶液的pH值 例如,H.7的0.1o的NaH2BO1和(.lnl1.的 Na:H1溶液在1倍稀释后pH为6.9,在倍稀释 后pH变为7.0) 3)1ris缓冲液的pH值在每10倍稀释后降低0.14