5.1.5电泳 5.1.6考马斯亮蓝染色……………… 90 5.1.7银染色 5.1.8干胶 1.9讨论 5.1.10安全注意事项…… 100 5.2梯度胶 5.2.1引言… ……101 5.2.2仪器 101 5.2.3凝胶的制备… 5.3SI)s-尿素胶…… 5.3.1引言 5.3.2制胶…………………………I04 5.4其他方法 105 5.4.1放射性标记样品的检测 05 5.4.2分子量的测定……………………105 5.4.3蛋白质定量… …I7 5.4.4电泳后蛋白质的洗脱 I(8 第六章非变性条件下的凝胶电泳 6.1引言 6.2不连续非变性凝胶电泳……2 6.2.【设备… 6.2.2制胶…… 6.2.3样品制备… 117 6.2.4电泳 l18 6.2.5凝胶染色 6.2.6连续非变性凝胶电泳 6.3相关的方法 ,甲· 6.3.1蛋白质分子量的测定 +;··;日-, 120 6.3.2电泳后酶活性的测定… I22
第七章等电聚焦和双向凝胶电泳………124 7.1等电聚焦… 124 7.1.1原理… 124 7.1.2主要仪器……………………125 7.1.3灌制等电聚焦凝胶………………125 7.1.4样品制备和上样……………………128 7.1.5等电聚焦电泳…… …………129 7.1.6聚焦后处理 L30 7.1.7天然等电聚焦电泳的修正方案 130 7.1.8讨论 131 7.2固相pH梯度等电聚焦电泳…………………I34 7.2.1简介 ……………………134 7.2.2仪器 ······ *·:·····∴ 135 7.2.3制备等电聚焦凝胶 ………………135 7.2.4样品制备和上样 7.2.5等电聚焦也泳… ………138 7.2.6聚焦后处理……… ………139 7.2.7讨论… 139 7.3双问凝胶电泳… ……………140 7.3.!简介 7.3.仪器 …………………140 7.3.3操作步骤 ……………………141 7.3.4讨论 …………………………144 第八章蛋白质的毛细管电泳分析 ……………148 8.1引;……………… ……148 8.2影响分离效率的几个因教…… 149 8.3柱制备技术… 8.3.!键合涂层… …151 8.3.2吸附涂… 15l 8.4不同分离条件的影啊 ……152
8.5毛细管电泳检测器 ……152 8.6实验操作 1153 8.6.1实验步骤 153 8.6.2操作条件选择 ………………………………153 8.6.3毛细管区带电泳 155 8.6.4毛细管等电聚焦 8.6.5毛细管凝胶电泳… ………159 8.6.6亲和毛细管电泳… 8.7应用实例 8.7.1聚丙烯酰胺涂层毛细管电泳柱的制备 16l 8.7.2毛细管凝胶电泳分离蛋白质 l62 8.7.3毛细管等电聚焦… 163 第九章免疫印迹 ………………………166 9.引言… 9.1.1免疫印迹用膜 ……167 9.1.2将蛋白质固定在膜上的其他应用 167 9.2免疫印迹操作 9.2.1仪器……………… 9.2.2试剂………………… ………l68 9.2.3操作步骤 …169 9.2.4其他检测方法的修正方案 ………178 9.2.5总蛋白质染色 181 9.2.6免疫印迹清除………………………182 9.3讨论 9.3.1膜的储存…… 9.3.2转移异常……… ………………183 9.3.3免疫印迹的其他应用………… 183 第十章离子交换层析… 189 1(3.1蛋白质纯化… ………189 10.1.1引言 新,,由身·P·山 vt·
10.L.2方法… 10.2蛋白质溶液的浓缩…………………………………210 10.3批量层析 ……210 第十一章凝胶过滤层析… 普甲中··.、甲甲·●p甲甲由省,,曲曲‘由·、 11.1蛋白质的纯化……… ……………………212 11.1.2方法 219 11.2更换蛋白质的缓冲液… 229 第十二章亲和层析 12.1引言…………………………………231 12.2亲和柱的制备……… 甲甲··鲁· 12.2.1配基固相化技术…… 12.2.2非特异洗脱的策略… 236 12.3特异分离技术……… 238 12.3.1抗体…… ……………238 12.3.2核酸 246 12.3.3凝集素 ……………250 12.3.4染料配基… 12.3.5固相化金属亲和层析… 257 12.3.6疏水作用层析… 第十三章蛋白质的晶体培养——悬滴结晶… 264 13.1引言………………………………264 13.2悬滴结晶法…… ………………266 13.2.1结晶原理 66 13.2.2第·阶段操作步骤…69 13.3设计最优结晶方案… 面44普 278 13.3.1稀溶液基质的微调……………279 13.3.2初始筛选的扩展………… 13.3.3蛋白质结晶的灵活性与困难… 284 第十四章cDNA法推断蛋白质的一级结构 287
14.1引言…………………………………287 14.2一般策略 鲁·,甲甲,甲甲甲 ………………………287 14.2.1蛋白质的纯化和肽段氨基酸序列分析…………287 14.2.2引物的设计……………………289 14.2.3用PCR扩增目的cNA片段 291 14.2.4cDNA的克隆及测序 14.2.5cDNA序列的分析及蛋白质…级结构的 确定… ……………………292 14.3PK-120的纯化及肽段氨基酸序列分析…………294 14.3.1仪器及材料… 294 14.3.2PK-120的纯化………………… 14.3,3分离纯化肽段及测定氨基酸序列………296 14.4部分分解多肽两端有关的CR法筛选PK-120 基因…… ……297 14.4.1仪器及材料… 14.4.2引物设计 ……………298 14.4.3R扩增… 14.4.4凝胶电泳提取!\A ·中 14.4.5测定碱基序列 20 0)9 14.5PK-120cDNA克隆 14.5.1仪器及材料……… …3 14.5.2杂交反应… 3H() 14.5.3c)A折测PK12级结构的特f.………3 附录1常用化学物质分子量 3(4 附录2一些蛋白质的分子量和等电点 308 附录3硫酸铵沉淀剂表… 310 附录4分光光度曲线 32