三)色谱法 1.薄层色谱法 在生物碱类成分分离和测定须结合生物碱的通性选择合适的 提取溶剂,需要采用化学方法提取和纯化,常用液-液萃取或 液-固萃取,或结合生物碱的特性进行纯化。常使用碱性展开 剂或在碱性气氛中展开。在薄层直接扫描定量时,须首先作 工作曲线,目的是考察工作曲线是否为通过原点的直线,以便 决定采用外标一点法或外标两点法进行定量,其次需要找出线 性范围,以便摸索样品点样量。采用薄层直接扫描定量还需要 随行对照品进行,同时要考察稳定性,同板、异板效应和精密 度等
26 (三)色谱法 1．薄层色谱法 在生物碱类成分分离和测定须结合生物碱的通性选择合适的 提取溶剂，需要采用化学方法提取和纯化，常用液-液萃取或 液-固萃取，或结合生物碱的特性进行纯化。常使用碱性展开 剂或在碱性气氛中展开。在薄层直接扫描定量时，须首先作一 工作曲线，目的是考察工作曲线是否为通过原点的直线，以便 决定采用外标一点法或外标两点法进行定量，其次需要找出线 性范围，以便摸索样品点样量。采用薄层直接扫描定量还需要 随行对照品进行，同时要考察稳定性，同板、异板效应和精密 度等
2.高效液相色谱可采用正相、反相和离子对色谱,其中以反 相高效液相色谱应用较多。在RP-HPLC中为了克服游离硅醇基 的影响,采取了以下的措施, (1)流动相方面的改进: a加入硅醇基抑制剂,最常用的硅醇基抑制剂是三乙胺; b在流动相中加入离子对试剂 c在流动相中加入季铵盐试剂,例如在水-甲醇流动相中加入 0.01mo/L的溴化四甲基胺。 机理是流动相不断地流入色谱柱后,即连续地添加掩蔽性试 剂(季胺盐),被分离的碱性化合物和硅醇基之间的相互作用被 阻碍,从而使生物碱类成分得到很好的分离。流动相中水甲醇 比例的改变以及pH的变化都不影响峰的对称性
27 2．高效液相色谱 可采用正相、反相和离子对色谱，其中以反 相高效液相色谱应用较多。在RP-HPLC中为了克服游离硅醇基 的影响，采取了以下的措施， (1)流动相方面的改进： a.加入硅醇基抑制剂，最常用的硅醇基抑制剂是三乙胺; b.在流动相中加入离子对试剂; c.在流动相中加入季铵盐试剂，例如在水-甲醇流动相中加入 0.01mol／L的溴化四甲基胺。 机理是流动相不断地流入色谱柱后，即连续地添加掩蔽性试 剂(季胺盐)，被分离的碱性化合物和硅醇基之间的相互作用被 阻碍，从而使生物碱类成分得到很好的分离。流动相中水-甲醇 比例的改变以及pH的变化都不影响峰的对称性
(2)固定相方面的改进: 选择碳链较短的键合相硅胶填料,例如c8比C1好。 (3)增加流动相的脂溶性 (4)调整流动相的pH值, pH>pKa+1或<pKa-1条件下用离子对试剂 (5)升高柱温
28 (2)固定相方面的改进： 选择碳链较短的键合相硅胶填料，例如C8比C18好。 (3)增加流动相的脂溶性 (4)调整流动相的pH值, pH > pKa+1或< pKa-1条件下用离子对试剂。 (5)升高柱温
基本流程 1)样品供试液制备:样品根据生物碱通性提取、净 化、定容制备供试液。(如利用生物碱溶于氯仿,生 物碱盐不溶于氯仿,通过萃取与反苯取达到提取净化, 再定容后制成样品供试液)。 2)标准液配制:先配成标准储备液,再配制成系列 标准液。 3)系统适应性:色谱柱、流动相、流速、检测器、 测试浪长等。 4)选择定量方式,并相应进样、检测、计算含量
29 基本流程 1）样品供试液制备：样品根据生物碱通性提取、净 化、定容制备供试液。（如利用生物碱溶于氯仿，生 物碱盐不溶于氯仿，通过萃取与反萃取达到提取净化， 再定容后制成样品供试液）。 2）标准液配制：先配成标准储备液，再配制成系列 标准液。 3）系统适应性： 色谱柱、流动相、流速、检测器、 测试波长等。 4）选择定量方式，并相应进样、检测、计算含量
3.气相色谱法 适用于有挥发性的,遇热不分解的生物碱类。 游离碱或盐都只能得到一个游离碱的色谱峰,但 生物碱盐在急速加热器中产生的酸对色谱柱和检 测器不利,所以一般多经提取后进柱。例如麻黄 碱、苦参碱和颠茄类生物碱
30 3．气相色谱法 适用于有挥发性的，遇热不分解的生物碱类。 游离碱或盐都只能得到一个游离碱的色谱峰，但 生物碱盐在急速加热器中产生的酸对色谱柱和检 测器不利，所以一般多经提取后进柱。例如麻黄 碱、苦参碱和颠茄类生物碱