浙江农业学报 Icta agniciturae Zhejiangensis I6(1):25~29,2004 免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫功能的影响 沈锦玉,刘问,曹铮,尹文林沈智华,钱冬,吴颖蕾 (浙江省淡水水产研究所,淅江湖州31301) 摘要:用3种不同免疫增强剂多糖( laminarin)、灭活细菌苗、壳聚多糖( chitosan)注射(分别为A、B、C组,对 照为D组)和添加饵料饲喂中华绒螯蟹(多糖为E组,灭活细菌苗为F组,壳聚多糖为G组,对照为H组) 在不同时间取样测定中华绒螯蟹血清中非特异性免疫指标的变化及中华绒螯蟹的免疫保护率。结果表明: 注射后48h,ABC组中华绒螯蟹血清中溶菌酶活力分别为0.185,0.234,0.233,对照组为0.094,经t检验 差异不显著;超氧化物歧化酶(SOD)的活力分别为283.2,263.5,289.8对照组为120.15,经t检验,AB组血 清中∞OD活力差异极显著,C组差异显著。口服免疫增强剂后第9天,血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶 (SOD)的活力明显高于对照组,经t检验,各组血清中溶菌酶活力与对照相比,差异极显著;SOD的活力与对 照相比,E组差异极显著,F、G组差异显著。注射免疫增强剂组蟹的免疫保护率达75%,而口服免疫增强剂 组与对照组相比较,蟹的免疫保护率没有明显的差异。壳聚糖经生产性试用,能较好地预防病害的发生 华绒螯蟹成活率比对照组提高10%以上 关键词:中华绒螯蟹;免疫增强剂;非特异性免疫;溶菌酶;SOD 中图分类号:S966.16 文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2004)01-002 Eifect of immunity- stimulants on immun ity function of Eriocheir sinensis SHEN Jiryu LI Wen, CAO Zhen, YN Wer lin, SHEN Zhi-hua, QIAN Dong, WU Ying-lei Zhejiang Institute d Fesh ater Fisheries, Hichou 313001, China) Abstract: The indices of mrspecific immunity of freshwater crab, Eriocheir sinensis injected or fed with laminarin(A) Aeromonas hydrophila bacterin(B)and chitosan(C) were measured. After the 48 h of post injecting, lysozyme activr ties of three experimental groups(A, B, and C) were 0. 185, 0. 234 and 0. 233, respectively, while the control group (D)was 0. 094. There were o significant differences between experimental and the control group by using t test. SOD activities of three experimental groups were 283. 2, 263. 5 and 289.8, respectively, while the contol group was 120. 15 There were highly significant differences between A and D, and B and D, but there was m significant difference between C and D. These results indicated that the three immunity stimulants might significantly elevate the or specific immunity of crab. After the9 days of postfeeding with medicated diet, the lysozyme activities of experimental group were higher han those of the control group. There was highly significant difference between experimental group and the control group by using ttest. The SOd activities of experimental group were also higher than those of the control group. There was high ly significant difference between E group and the control group(D), whereas there were significant diferences between F and the control group, and G group and the control group. The crab fed by immunity stimulants could significantly ir crease the or specific immunity of crab. The chitosan used in the fields could efficiently prevent the occurrence of crab disease and increased the survival rate of crab by >10 compared with the control group Key words Eriocheir sinensis; immunity- stimulants; orr specific immunity lysozyme; SOD 收稿日期:2003-07-28 金项目:浙江省科技厅重点项目(991102312) 作者简介:沈锦玉(1963-),女浙江湖州人,副研究员,从事水生动物病害防治研究 2 0/994-2008 China Academic Journal Electronic Publls/mg House. All rights reserved. hfp: //nnvcnki.net
浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 16 (1) :25～29 ,2004 免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫功能的影响 沈锦玉 ,刘 问 ,曹 铮 ,尹文林 ,沈智华 ,钱 冬 ,吴颖蕾 (浙江省淡水水产研究所 , 浙江 湖州 313001) 摘 要 :用 3 种不同免疫增强剂多糖(laminarin) 、灭活细菌苗、壳聚多糖(chitosan) 注射(分别为 A、B、C 组 ,对 照为 D 组) 和添加饵料饲喂中华绒螯蟹(多糖为 E 组 ,灭活细菌苗为 F 组 ,壳聚多糖为 G组 ,对照为 H 组) , 在不同时间取样测定中华绒螯蟹血清中非特异性免疫指标的变化及中华绒螯蟹的免疫保护率。结果表明 : 注射后 48 h , A、B、C 组中华绒螯蟹血清中溶菌酶活力分别为 0. 185 ,0. 234 ,0. 233 ,对照组为 0. 094 ,经 t 检验 , 差异不显著 ;超氧化物歧化酶(SOD) 的活力分别为 283. 2 ,263. 5 ,289. 8 ,对照组为 120. 15 ,经 t 检验 ,A、B 组血 清中 SOD 活力差异极显著 ,C 组差异显著。口服免疫增强剂后第 9 天 ,血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 的活力明显高于对照组 ,经 t 检验 ,各组血清中溶菌酶活力与对照相比 ,差异极显著 ;SOD 的活力与对 照相比 ,E组差异极显著 ,F、G组差异显著。注射免疫增强剂组蟹的免疫保护率达 75 % ,而口服免疫增强剂 组与对照组相比较 ,蟹的免疫保护率没有明显的差异。壳聚糖经生产性试用 ,能较好地预防病害的发生 ,中 华绒螯蟹成活率比对照组提高 10 %以上。 关键词 :中华绒螯蟹 ;免疫增强剂 ;非特异性免疫 ;溶菌酶 ;SOD 中图分类号 :S966. 16 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 1524(2004) 01 - 0025 - 05 Effect of immunity2stimulants on immunity function of Eriocheir sinensis SHEN Jin2yu ,LIU Wen ,CAO Zhen ,YIN Wen2lin ,SHEN Zhi2hua ,QIAN Dong ,WU Ying2lei ( Zhejiang Institute of Feshwater Fisheries , Huzhou 313001 , China) Abstract :The indices of non2specific immunity of freshwater crab , Eriocheir sinensis ,injected or fed with laminarin(A) , Aeromonas hydrophila bacterin (B) and chitosan (C) were measured. After the 48 h of post2injecting , lysozyme activi2 ties of three experimental groups (A , B , and C) were 0. 185 , 0. 234 and 0. 233 , respectively , while the control group (D) was 0. 094. There were no significant differences between experimental and the control group by using t test. SOD activities of three experimental groups were 283. 2 , 263. 5 and 289. 8 , respectively , while the control group was 120. 15. There were highly significant differences between A and D , and B and D , but there was no significant difference between C and D. These results indicated that the three immunity2stimulants might significantly elevate the non2specific immunity of crab. After the 9 days of post2feeding with medicated diet , the lysozyme activities of experimental group were higher than those of the control group. There was highly significant difference between experimental group and the control group by using t2test. The SOD activities of experimental group were also higher than those of the control group. There was high2 ly significant difference between E group and the control group (D) , whereas there were significant differences between F and the control group , and G group and the control group. The crab fed by immunity2stimulants could significantly in2 crease the non2specific immunity of crab. The chitosan used in the fields could efficiently prevent the occurrence of crab disease and increased the survival rate of crab by > 10 % compared with the control group. Key words : Eriocheir sinensis; immunity2stimulants ; non2specific immunity ; lysozyme ; SOD 收稿日期 :2003 - 07 - 28 基金项目 :浙江省科技厅重点项目(991102312) 作者简介 :沈锦玉(1963 - ) ,女 ,浙江湖州人 ,副研究员 ,从事水生动物病害防治研究。 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
26· 浙江农业学报第16卷(20 近几年,中华绒螯蟹( Eriocheir sinensis)已重。各组中华绒螯蟹分别在注射后3,6,24,48 成为我国名特优水产养殖的主要品种之一,但72,%6h取样3只,附肢取血,待血液凝固后,取 是细菌性与病毒性等疾病不断发生3,严重血清,待测。 影响生产。蟹病防治已成为当务之急,除常规1.2.2口服免疫增强剂 药物防治外,针对甲壳类不具备特异性免疫系 4个处理组:E组为多糖,药物终浓度为 统的生理特点,可以采用免疫增强剂来启动和g/kg体重,以体重5%的投饵率,每50kg饵料 调节中华绒螯蟹非特异性免疫,提高其自身免中的添加量为25g;F组为菌苗(同B组),添加 疫能力。目前国内外鱼用免疫增强剂的研究比量为1%。G组为壳聚多糖,以1%的溶液拌于 较活跃31,对甲壳动物的免疫增强剂也有不饲料中,终浓度为0.2%;H组为基础饵料(对照 少研究6-81。中国对虾、南美白对虾等甲壳类组)。基础饵料购自浙江湖州饲料厂。制备各 注射或服用含多糖等成分的免疫增强剂后,可组饵料时,将添加物直接加入基础饵料中,用绞 刺激其免疫系统,提高防御能力,达到防病治肉机挤压成型,日光下晒干或烘干。各组中华 病,提高成活率的目的。但免疫增强剂对中华绒螯蟹连续口服1月,分别在口服后第3天开 绒螯蟹的非特异性免疫的研究尚未见报道。本始取样,每组取样3只,每3天测1次,共测7 试验采用3种免疫增强剂通过注射或作为饲料次,血清制备同1.2.1节。 添加剂饲喂中华绒螯蟹,测定其对中华绒螯蟹1.3测定方法 血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)及免疫保1.3.1溶菌酶活力 护率的影响,从而筛选合适的免疫增强剂,为甲 以溶壁微球菌( Micrococcus /ysoleiticus)(购 壳类的病害防治提供科学依据。 自中科院微生物所菌种室)冻干粉为底物,按 Hultmark等人的方法进行。将底物用0.1 1材料与方法 ml/LpH为6.4的磷酸钾盐缓冲液配成底物悬 液(OD3≈0.3)。取3m1该悬液50叫,待测血 1.1材料 清于试管中混匀,测其Ao值。然后将试液移入 健康中华绒螯蟹购自浙江湖州某养蟹场 37℃水浴中保温30mn,取出后立刻置于冰浴中 体重50~70g,饲养于1m3的水泥池中,水温2610min以终止反应,测其A值。溶菌活力U按下 ~28℃,每池饲养15只。每组3只池,池内放适式计算U=(Ao-A)/A。式中U为溶菌活力; 量喜旱莲子草,瓦片等,每天投喂2次约占体重AO为反应前光密度值;A为反应后光密度值。 5%的蟹配合饲料。暂养1周后供试验用。 1.3.2超氧化物歧化酶(SOD)活力 1.2试验处理 参照邓碧玉等的方法进行。测定时,将 1.2.1注射免疫增强剂 50mml/LpH为8.3的磷酸缓冲液4.5m与50 4个处理组:A组为多糖( laminarin,购自m/L连苯三酚10叫混合并迅速摇匀,于直径 gm公司),配成1%的生理盐水溶液,每100g1cm的比色杯,在325m波长下每间隔20s测光 体重的蟹注射0.2m,B组为中华绒螯蟹的细菌密度值A一次,要求自氧化速率每分钟OD2s值 灭活苗(α9990),细菌在大豆胰蛋白胨培养液变化约0.07。酶活性测定方法与此相同,在加入 (TSB)中,经200r/min,28℃的摇床培养24h,加连苯三酚前,加入待测的血清50叫,室温下混匀, 0.2%福尔马林灭活24h,离心5000r/mn,20测得数据按下式计算酶活性 min,用无菌生理盐水洗涤2次,以10 cfu/ ml浓 酶活性=(0.07-Ax/min)/(0.07×50%) 度,每100g体重蟹注射0.2mC组为壳聚多糖100%×反应液体积X样液稀释倍数/样液体积 ( chitosan),l%〔 Chitosan溶解于0.5%醋酸无菌 酶活单位定义每m反应液中,每mn抑制 生理盐水pH调至6.8,0.2m/100g蟹体重;D连苯三酚自氧化速率达50%的酶量为1个酶活 组为对照组,注射生理盐水0.2m/l00g蟹体单位U/m)。 2 01994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. hp: //nwr. cnkiner
近几年 ,中华绒螯蟹 ( Eriocheir sinensis ) 已 成为我国名特优水产养殖的主要品种之一 ,但 是细菌性与病毒性等疾病不断发生[1～3 ] ,严重 影响生产。蟹病防治已成为当务之急 ,除常规 药物防治外 ,针对甲壳类不具备特异性免疫系 统的生理特点 ,可以采用免疫增强剂来启动和 调节中华绒螯蟹非特异性免疫 ,提高其自身免 疫能力。目前国内外鱼用免疫增强剂的研究比 较活跃[4～5 ] ,对甲壳动物的免疫增强剂也有不 少研究[6～8 ] 。中国对虾、南美白对虾等甲壳类 注射或服用含多糖等成分的免疫增强剂后 ,可 刺激其免疫系统 ,提高防御能力 ,达到防病治 病 ,提高成活率的目的。但免疫增强剂对中华 绒螯蟹的非特异性免疫的研究尚未见报道。本 试验采用 3 种免疫增强剂通过注射或作为饲料 添加剂饲喂中华绒螯蟹 ,测定其对中华绒螯蟹 血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD) 及免疫保 护率的影响 ,从而筛选合适的免疫增强剂 ,为甲 壳类的病害防治提供科学依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 健康中华绒螯蟹购自浙江湖州某养蟹场 , 体重 50～70 g ,饲养于 1 m3 的水泥池中 ,水温 26 ～28 ℃,每池饲养 15 只。每组 3 只池 ,池内放适 量喜旱莲子草 ,瓦片等 ,每天投喂 2 次约占体重 5 %的蟹配合饲料。暂养 1 周后供试验用。 1. 2 试验处理 1. 2. 1 注射免疫增强剂 4 个处理组 : A 组为多糖 (laminarin ,购自 Sigma 公司) ,配成 1 %的生理盐水溶液 ,每 100 g 体重的蟹注射 0. 2 ml ;B 组为中华绒螯蟹的细菌 灭活苗(CL99920) ,细菌在大豆胰蛋白胨培养液 (TSB) 中 ,经 200 r/ min ,28 ℃的摇床培养 24 h ,加 0. 2 %福尔马林灭活 24 h ,离心 5 000 r/ min ,20 min ,用无菌生理盐水洗涤 2 次 ,以 109 cfu/ ml 浓 度 ,每 100 g 体重蟹注射 0. 2 ml ;C 组为壳聚多糖 (chitosan) ,1 % Chitosan 溶解于 0. 5 %醋酸无菌 生理盐水 ,pH 调至 6. 8 ,0. 2 ml/ 100g 蟹体重 ;D 组为对照组 ,注射生理盐水 0. 2 ml/ 100g 蟹体 重。各组中华绒螯蟹分别在注射后 3 ,6 ,24 ,48 , 72 ,96 h 取样 3 只 ,附肢取血 ,待血液凝固后 ,取 血清 ,待测。 1. 2. 2 口服免疫增强剂 4 个处理组 : E 组为多糖 ,药物终浓度为 1 g/ kg 体重 ,以体重 5 %的投饵率 ,每 50 kg 饵料 中的添加量为 25 g ; F 组为菌苗 (同 B 组) ,添加 量为 1 %。G组为壳聚多糖 ,以 1 %的溶液拌于 饲料中 ,终浓度为 0. 2 % ; H 组为基础饵料(对照 组) 。基础饵料购自浙江湖州饲料厂。制备各 组饵料时 ,将添加物直接加入基础饵料中 ,用绞 肉机挤压成型 ,日光下晒干或烘干。各组中华 绒螯蟹连续口服 1 月 ,分别在口服后第 3 天开 始取样 ,每组取样 3 只 ,每 3 天测 1 次 ,共测 7 次 ,血清制备同 1. 2. 1 节。 1. 3 测定方法 1. 3. 1 溶菌酶活力 以溶壁微球菌( Micrococcus lysoleiticus ) (购 自中科院微生物所菌种室) 冻干粉为底物 ,按 Hultmark 等人[9 ] 的方法进行。将底物用 0. 1 mol/ L ,pH 为 6. 4 的磷酸钾盐缓冲液配成底物悬 液(OD570≈0. 3) 。取 3 m1 该悬液 50μl ,待测血 清于试管中混匀 ,测其 Ao 值。然后将试液移入 37 ℃水浴中保温 30 min ,取出后立刻置于冰浴中 10 min 以终止反应 ,测其 A 值。溶菌活力 U 按下 式计算:U = (Ao - A)/ A。式中:U 为溶菌活力; Ao 为反应前光密度值;A 为反应后光密度值。 1. 3. 2 超氧化物歧化酶(SOD)活力 参照邓碧玉等[10]的方法进行。测定时 ,将 50 mmol/ L pH为 8. 3 的磷酸缓冲液 4. 5 ml 与 50 mmol/ L 连苯三酚 10μl 混合并迅速摇匀 ,于直径 1 cm 的比色杯 ,在325 nm 波长下每间隔20 s 测光 密度值 A 一次 ,要求自氧化速率每分钟 OD325值 变化约 0. 07。酶活性测定方法与此相同 ,在加入 连苯三酚前 ,加入待测的血清 50μl ,室温下混匀 , 测得数据按下式计算酶活性: 酶活性 = (0. 07 - A325/ min)/ (0. 07 ×50 %) × 100 % ×反应液体积 ×样液稀释倍数/ 样液体积 酶活单位定义 :每 ml 反应液中 ,每 min 抑制 连苯三酚自氧化速率达 50 %的酶量为 1 个酶活 单位(U/ ml) 。 · 62 · 浙江农业学报 第 16 卷(2004) © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
沈锦玉等:免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫功能的影响 1.3.3免疫保护率 提高,经t检验AB组血清中SOD活力与对照 中华绒螯蟹注射免疫增强剂2d或口服21相比,差异极显著C组差异显著 d后,用中华绒螯蟹致病菌嗜水气单胞菌 从表2结果可以看出,注射免疫增强剂组蟹 a9920以1×103,1×10°个/ml菌含量注射蟹的死亡率低于对照组,说明中华绒螯蟹对细菌的 的第三步足基部,注射量0.1ml只,每组8只 攻击具有明显的保护作用,免疫保护率为75% 对照组注射无菌生理盐水,剂量同试验组,饲养 水温26~27℃。免疫保护率=(对照组死亡率表2注射免疫增强剂后各处理组的保护率试验 免疫组死亡率)/对照组死亡率×00% Table 2 Protecting test of various treatments after injecting 1.4免疫增强剂的应用试验 mmunity-stimulants 将壳聚糖添加在饲料中,浓度为0.2%,在 处理细菌试验不同死亡时间(的累计死亡数死亡免疫 浓度 疾病流行季节,投喂未给发病蟹的中华绒螯蟹 225.075.0 连续投喂9d,隔7d再投喂。试验分别在上海 00000 崇明及浙江湖州的养蟹场进行 133325.574.5 122225.075.0 结果 7888100 2.1注射不同免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫 功能的影响 2.2口服不同免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫 中华绒螯蟹注射3种免疫增强剂后,溶菌功能的影响 酶活力、SOD活力测定结果见表1。血清中溶菌 中华绒螯蟹经口服免疫增强剂后,血清中溶 活力随时间延长逐渐增高,至48h达到最高值 菌酶及S∞D的活力比注射组提高慢至第9天酶 至72h其活力减弱。经t检验,差异不显著 活性明显高于对照组经t检验,各组血清中溶菌 SOD的活力与溶菌酶的结果相似,48h时最高, 酶活力与对照相比,差异极显著;SOD的活力与 随后逐渐下降,3种免疫增强剂组比对照组明显 对照相比,E组差异极显著,F、G组差异显著 表1注射免疫增强剂对中华绒螯蟹血清中溶菌酶和 表3口服免疫增强剂对中华绒螯蟹血清中溶菌酶和 超氧化物歧化酶活力的影响 超氧化物歧化酶活力的影响 Table 1 Bects of injecting immunity- stimulants on lysozyme Table 3 Hlects of oral immunity-stimulants on lysozyme and and SOD activity in crab serum SOD activity in crab serum 测定项目及时间d 测完项目及时间/h 溶菌酶酶活力 溶菌酶活力 0.1430.1020.061 003 0.1600.1800.074 0.1300.1360.1940.137 0.1880.1820.1770.069 0.1750.1610.199 0. 0.2340.2330.092 0.0880.1390.1190.086 0.027 0.0590.0910.0580.113 I <to os t <to os t <toos 0.1120.1720.1520.084 超氧化物歧化酶活力 151.5158.1138.3105.4 超氧化物歧化酶活力 256.8223.9250.3 135.9131.2106.8101.0 151.4146.6139.987.3 274.6261.5230.5150.3 144.1 283.2263.4289.8118.5 10.4116.8108.399 110.4 2138.3158.0115.8 39.4121.5165.9113.5 140.3118.9172.788.6 注酶活单位见1.3节 t>tnn nm >t>nos on >t>tons. 201994-2008ChinaacademieJOurnalElectronicPublishinghOuse.Allnightsreservedhttp:/nn.cnkiner
1. 3. 3 免疫保护率 中华绒螯蟹注射免疫增强剂 2 d 或口服 21 d 后 , 用 中 华 绒 螯 蟹 致 病 菌 嗜 水 气 单 胞 菌 CL99920 以 1 ×107 ,1 ×106 个/ m1 菌含量注射蟹 的第三步足基部 ,注射量 0. 1 m1/ 只 ,每组 8 只 , 对照组注射无菌生理盐水 ,剂量同试验组 ,饲养 水温 26～27 ℃。免疫保护率 = (对照组死亡率 - 免疫组死亡率) / 对照组死亡率 ×100 %。 1. 4 免疫增强剂的应用试验 将壳聚糖添加在饲料中 ,浓度为 0. 2 % ,在 疾病流行季节 ,投喂未给发病蟹的中华绒螯蟹 , 连续投喂 9 d ,隔 7 d 再投喂。试验分别在上海 崇明及浙江湖州的养蟹场进行。 2 结果 2. 1 注射不同免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫 功能的影响 中华绒螯蟹注射 3 种免疫增强剂后 ,溶菌 酶活力、SOD 活力测定结果见表 1。血清中溶菌 活力随时间延长逐渐增高 ,至 48 h 达到最高值 , 至 72 h 其活力减弱。经 t 检验 ,差异不显著。 SOD 的活力与溶菌酶的结果相似 ,48 h 时最高 , 随后逐渐下降 ,3 种免疫增强剂组比对照组明显 表 1 注射免疫增强剂对中华绒螯蟹血清中溶菌酶和 超氧化物歧化酶活力的影响 Table 1 Effects of injecting immunity2stimulants on lysozyme and SOD activity in crab serum 测定项目及时间/ h A B C D 溶菌酶酶活力 3 0. 074 0. 143 0. 102 0. 061 6 0. 188 0. 160 0. 180 0. 074 24 0. 130 0. 136 0. 194 0. 137 48 0. 185 0. 234 0. 233 0. 092 72 0. 088 0. 139 0. 119 0. 086 96 0. 059 0. 091 0. 058 0. 113 t 检验 t < t0. 05 t < t0. 05 t < t0. 05 超氧化物歧化酶活力 3 151. 5 158. 1 138. 3 105. 4 6 256. 8 223. 9 250. 3 121. 3 24 274. 6 261. 5 230. 5 150. 3 48 283. 2 263. 4 289. 8 118. 5 72 250. 3 191. 1 164. 6 109. 6 96 191. 2 138. 3 158. 0 115. 8 t 检验 t > t0. 01 t > t0. 01 t0. 01 > t > t0. 05 注 :酶活单位见 1. 3 节。 提高 ,经 t 检验 ,A、B 组血清中 SOD 活力与对照 相比 ,差异极显著 ,C 组差异显著。 从表 2 结果可以看出 ,注射免疫增强剂组蟹 的死亡率低于对照组 ,说明中华绒螯蟹对细菌的 攻击具有明显的保护作用 ,免疫保护率为 75 %。 表 2 注射免疫增强剂后各处理组的保护率试验 Table 2 Protecting test of various treatments after injecting immunity2stimulants 处理 细菌 浓度/ cfu·ml - 1 试验 总数/ 只 不同死亡时间(h)的累计死亡数 24 48 72 96 死亡 率/ % 免 疫 保 护 率/ % A 107 8 0 2 2 2 25. 0 75. 0 106 8 0 0 0 0 0 B 107 8 1 3 3 3 25. 5 74. 5 106 8 0 0 0 0 0 C 107 8 1 2 2 2 25. 0 75. 0 106 8 0 0 0 0 0 D 107 8 7 8 8 8 100 106 8 0 0 0 0 0 2. 2 口服不同免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫 功能的影响 中华绒螯蟹经口服免疫增强剂后 ,血清中溶 菌酶及 SOD 的活力比注射组提高慢 ,至第 9 天酶 活性明显高于对照组 ,经 t 检验 ,各组血清中溶菌 酶活力与对照相比 ,差异极显著;SOD 的活力与 对照相比 ,E 组差异极显著 ,F、G组差异显著。 表 3 口服免疫增强剂对中华绒螯蟹血清中溶菌酶和 超氧化物歧化酶活力的影响 Table 3 Effects of oral immunity2stimulants on lysozyme and SOD activity in crab serum 测定项目及时间/ d E F G H 溶菌酶活力 3 0. 090 0. 085 0. 076 0. 059 6 0. 134 0. 073 0. 120 0. 037 9 0. 188 0. 182 0. 177 0. 069 12 0. 175 0. 161 0. 199 0. 019 15 0. 150 0. 14 0. 139 0. 017 18 0. 169 0. 11 0. 117 0. 027 21 0. 112 0. 172 0. 152 0. 084 t 检验 t > t0. 01 t > t0. 01 t > t0. 01 超氧化物歧化酶活力 3 135. 9 131. 2 106. 8 101. 0 6 151. 4 146. 6 139. 9 87. 3 9 144. 1 138. 9 178. 6 104. 5 12 110. 4 116. 8 108. 3 99. 7 15 127. 5 110. 4 109. 8 102. 3 18 139. 4 121. 5 165. 9 113. 5 21 140. 3 118. 9 172. 7 88. 6 t 检验 t > t0. 01 t0. 01 > t > t0. 05 t0. 01 > t > t0. 05 沈锦玉等 :免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫功能的影响 · 72 · © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
浙江农业学报第16卷(2004) 从表4结果可以看出,口服免疫增强剂组苗,全菌苗的主要作用是细胞壁中粘多糖(LPS) 蟹的死亡率与对照组相同,说明口服免疫增强的糖苷键,主要作用于嗜中性白细胞和巨噬细 剂后中华绒螯蟹对强毒攻击没有明显保护作胞还能促进鱼类M的生成。对虾口服弧菌 疫苗后产量可提高8%~10%,死亡率减 少-1。C组为壳聚糖,壳聚糖是一种肽聚 表4口服免疫增强剂后各处理组的保护率试验 糖。它能促进对虾苗的生长,并具有抗菌防病 Table 4 Protecting test of various treatments after oral immer 作用8。经试验证实,3种不同物质B-1,3葡聚 nity-stimulants 糖、灭活细菌苗、壳聚多糖作为免疫增强剂通过 注射或添加入饲料中饲喂中华绒螯蟹,血清中 溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)的活性明显高于 E1078 对照组,均可作为免疫增强剂,体现出类似的生 F1078 10°8 物学活性,具有刺激中华绒螯蟹的非特异性免 G1078 疫功能的作用增强了防御系统。而β-1,3葡聚 10°8 ∞∞ H1078 糖为购自 Sigma公司的免疫增强剂,价格昂贵 灭活细菌苗易制备,壳聚多糖来源丰富,价格合 理,为广大养殖户所接受。因此,灭活菌苗和壳 2.3口服免疫增强剂的应用试验 聚多糖可作为免疫增强剂开发,可以在中华绒 上海崇明某养殖场,总面积约133hm2,其 螯蟹养殖生产中得以应用 中53.3hm养殖池的中华绒螯蟹投喂含壳聚糖 从表1与表3中可看出,注射法比药饵法 的配合饲料,整个养殖过程中,投喂组中华绒螯 的效果要好,作用快,在更短的时间内出现明显 蟹的成活率比对照组提高约15%。浙江湖州某的效果。但这种方法操作繁琐且费用高,一时 养蟹场总面积约26hm2,其中5.7hm2投喂含壳尚难应用于规模化生产中。而通过口服药饵 聚糖的饲料,与对照组相比,中华绒螯蟹的生长法,出现的效应时间较长,给药途径在生产实践 情况较好,病害发生率下降,成活率提高约上更为实用,操作方便,成本低,便于在大面积 12%说明免疫增强剂如壳聚糖能较好地调节养殖中使用,是施以免疫激活剂较理想的方法 非特异性免疫,增强中华绒螯蟹对疾病的抵抗 免疫增强剂的给药时间极其重要,它不同 力,减少病害的发生,提高中华绒螯蟹的成活于抗生素用于疾病的发生时期或初期。免疫增 率 强剂的主要作用在于调节或改善机体的免疫功 能,即当机体的免疫功能下降或被抑制时,免疫 3讨论 增强剂就能提高机体的免疫能力。给药时间的 长短也是免疫增强剂发挥作用的一个关键因 抗菌素是目前水生动物防治病害的常用药素。从表1可知,注射48h后,溶菌酶和SOD活 物,但易带来药物残留等问题。另外,多次使用力明显提高,而用药饵饲喂中华绒螯蟹9d后, 会产生耐药性菌株和塘泥污染的危害。最近,既能明显提高SOD,又能显著增强溶菌酶活力 国内对这类药物的使用作了严格的限制山。因 从而提高了中华绒螯蟹的非特异性免疫能力 此,开展免疫激活剂在水产养殖业上应用的研21d时的效果与9d时的相似,无明显差别。因 究,具有更广阔的前景 此,作者认为这些免疫增强剂如多糖、全菌苗和 本研究中应用的A组为微生物多糖类β-1,壳聚糖按一定的量加入饲料中饲喂中华绒螯 3葡聚糖( (laminarin)作为阳性对照,葡聚糖的免蟹,可达到理想效果,且一个疗程的最佳时间为 疫增强效果已得广泛研究,并且对不同水生动9d。经生产单位试用,壳聚糖能较好地预防病 物具有广谱的免疫增强作用12。B组为全菌害的发生提高养殖成活率,可以在水产养殖业 2 01994-2008 China Academic Journal Electronie Publishing House. All rights reserved. hp: /wn cnki.net
从表 4 结果可以看出 ,口服免疫增强剂组 蟹的死亡率与对照组相同 ,说明口服免疫增强 剂后中华绒螯蟹对强毒攻击没有明显保护作 用。 表 4 口服免疫增强剂后各处理组的保护率试验 Table 4 Protecting test of various treatments after oral immu2 nity2stimulants 处理 细菌 浓度/ cfu·ml - 1 试验 总数/ 只 不同死亡时间(h)的累计死亡数 24 48 72 96 死亡 率/ % E 107 8 2 6 6 8 100 106 8 0 0 0 0 0 F 107 8 4 6 8 8 100 106 8 0 0 0 0 0 G 107 8 3 5 8 8 100 106 8 0 0 0 0 0 H 107 8 8 8 8 8 100 106 8 0 0 0 0 0 2. 3 口服免疫增强剂的应用试验 上海崇明某养殖场 ,总面积约 133 hm2 ,其 中 53. 3 hm2 养殖池的中华绒螯蟹投喂含壳聚糖 的配合饲料 ,整个养殖过程中 ,投喂组中华绒螯 蟹的成活率比对照组提高约 15 %。浙江湖州某 养蟹场总面积约 26 hm2 ,其中 5. 7 hm2 投喂含壳 聚糖的饲料 ,与对照组相比 ,中华绒螯蟹的生长 情况较好 , 病害发生率下降 , 成活率提高约 12 %。说明免疫增强剂如壳聚糖能较好地调节 非特异性免疫 ,增强中华绒螯蟹对疾病的抵抗 力 ,减少病害的发生 ,提高中华绒螯蟹的成活 率。 3 讨论 抗菌素是目前水生动物防治病害的常用药 物 ,但易带来药物残留等问题。另外 ,多次使用 会产生耐药性菌株和塘泥污染的危害。最近 , 国内对这类药物的使用作了严格的限制[11 ] 。因 此 ,开展免疫激活剂在水产养殖业上应用的研 究 ,具有更广阔的前景。 本研究中应用的 A 组为微生物多糖类β21 , 3 葡聚糖(laminarin) 作为阳性对照 ,葡聚糖的免 疫增强效果已得广泛研究 ,并且对不同水生动 物具有广谱的免疫增强作用[12 ] 。B 组为全菌 苗 ,全菌苗的主要作用是细胞壁中粘多糖 (LPS) 的糖苷键 ,主要作用于嗜中性白细胞和巨噬细 胞 ,还能促进鱼类 IgM 的生成。对虾口服弧菌 疫苗 后 产 量 可 提 高 8 % ～ 10 % , 死 亡 率 减 少[13～14 ] 。C 组为壳聚糖 ,壳聚糖是一种肽聚 糖。它能促进对虾苗的生长 ,并具有抗菌防病 作用[8 ] 。经试验证实 ,3 种不同物质β21 ,3 葡聚 糖、灭活细菌苗、壳聚多糖作为免疫增强剂通过 注射或添加入饲料中饲喂中华绒螯蟹 ,血清中 溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD) 的活性明显高于 对照组 ,均可作为免疫增强剂 ,体现出类似的生 物学活性 ,具有刺激中华绒螯蟹的非特异性免 疫功能的作用 ,增强了防御系统。而β21 ,3 葡聚 糖为购自 Sigma 公司的免疫增强剂 ,价格昂贵 ; 灭活细菌苗易制备 ,壳聚多糖来源丰富 ,价格合 理 ,为广大养殖户所接受。因此 ,灭活菌苗和壳 聚多糖可作为免疫增强剂开发 ,可以在中华绒 螯蟹养殖生产中得以应用。 从表 1 与表 3 中可看出 ,注射法比药饵法 的效果要好 ,作用快 ,在更短的时间内出现明显 的效果。但这种方法操作繁琐且费用高 ,一时 尚难应用于规模化生产中。而通过口服药饵 法 ,出现的效应时间较长 ,给药途径在生产实践 上更为实用 ,操作方便 ,成本低 ,便于在大面积 养殖中使用 ,是施以免疫激活剂较理想的方法。 免疫增强剂的给药时间极其重要 ,它不同 于抗生素用于疾病的发生时期或初期。免疫增 强剂的主要作用在于调节或改善机体的免疫功 能 ,即当机体的免疫功能下降或被抑制时 ,免疫 增强剂就能提高机体的免疫能力。给药时间的 长短也是免疫增强剂发挥作用的一个关键因 素。从表 1 可知 ,注射 48 h 后 ,溶菌酶和 SOD 活 力明显提高 ,而用药饵饲喂中华绒螯蟹 9 d 后 , 既能明显提高 SOD ,又能显著增强溶菌酶活力 , 从而提高了中华绒螯蟹的非特异性免疫能力 , 21 d 时的效果与 9 d 时的相似 ,无明显差别。因 此 ,作者认为这些免疫增强剂如多糖、全菌苗和 壳聚糖按一定的量加入饲料中饲喂中华绒螯 蟹 ,可达到理想效果 ,且一个疗程的最佳时间为 9 d。经生产单位试用 ,壳聚糖能较好地预防病 害的发生 ,提高养殖成活率 ,可以在水产养殖业 · 82 · 浙江农业学报 第 16 卷(2004) © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
沈锦玉等:免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫功能的影响 中推广应用 对虾病害防治作用的研究]海洋与湖沼,1994,25(5) 注射免疫增强剂后,第二天测定其免疫保 护率为75%。而口服免疫增强剂,经病原菌攻1刘恒,李光友,免疫多糖对养殖南美白对虾作用的研究 [.海洋与湖沼,1998。29(2):113-117 击后,免疫增强剂组的死亡率与对照组没有明 8]庄承纪,刘劲科,杨清友,等.壳多糖对罗氏沼虾、斑节对 显差异:一是可能细菌攻击的时间不合适;二是 虾苗生长和抗菌防病作用研究卩].湛江海洋大学学报 可能没有准确掌握攻击菌的浓度,即应该在107 1998,18(3):29-34 与10°之间找到一个更合适的浓度;三是可能口 服免疫增强剂虽能提高非特异性免疫,但其作 three inducible bactericidal proteins fiom hemolymph of ir 用较小,不足以抵抗强毒力菌的一次性攻击 muneized pupae of Hyalophera cecropia. Eur J Biochem 关于这方面的问题有待进一步研究。 [10]邓碧玉,袁勤,李文杰,等.改良后的连苯三酚自氧化测 超氧化物歧化酶活性的方法[].生物化学与生物物 参考文献 理进展,1991,18(2) []姜静颖,邢殿楼,王斌,等。池塘养殖中华绒蝥蟹幼蟹的 1]l周德庆,李晓川,李兆新等,无公害食品水产品中渔药 种球状病毒粒子的电镜观察J].大连水产学院学报 残留限量[].中华人民共和国农业行业标准(NY5070 96,11(1):51-53 002)2002,361-369 [2]陆宏达,范丽萍薛美.中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病及 [12] D LuZo NR. Immuophamaoology of glucan: a broad spec- 其组织病理学UJ].水产学报,199,231)61-68 trum enhancer of host defence mechanisms [J]. Trends [3]沈锦玉,尹文林,钱冬等.中华绒蝥蟹“腹水病”及“抖抖 Pharmacol Sai.1983 4: 344-347 病”并发病病原的研究[].中国水产科学,2000,7(3):89 [13 Sakai M, Atsuta S, Kobayashi M. The activation of leucocytes in rainbow trout, Oncorinynchues mykiss, by oral administration [4 Fletcher IC. Norrspecific defense mechanisms of fishJ I of Clastnidi um butyricum bacterin[A]. Hanff JR, Subasinghe Developmental and Cooparative Immunology Suppl, 1982, 10 RP Diseases in Asian Aquaculture l[C]. Manila: Fish (2):123·132 Health Section, Asian Fisheries Society, 1995. 427-431 5]吴志新,陈强,陈昌福.左旋咪唑对异育银鲫免疫促进作 [14] Sung HH, Song Y, Kou GH. Potertial uses of bacterin to 用的初步研究[].华中农业大学学报,1998,17(4):378 prevent shrimp vibriosis]. Fish Shellfish Immunol, 1991 1:311-312 6]王雷,李光友,毛远兴,等.口服免疫型药物对养殖中 (责任编辑袁醉敏) 2o1994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://wrcnkiner
中推广应用。 注射免疫增强剂后 ,第二天测定其免疫保 护率为 75 %。而口服免疫增强剂 ,经病原菌攻 击后 ,免疫增强剂组的死亡率与对照组没有明 显差异 :一是可能细菌攻击的时间不合适 ;二是 可能没有准确掌握攻击菌的浓度 ,即应该在 107 与 106 之间找到一个更合适的浓度 ;三是可能口 服免疫增强剂虽能提高非特异性免疫 ,但其作 用较小 ,不足以抵抗强毒力菌的一次性攻击。 关于这方面的问题有待进一步研究。 参考文献 : [1 ] 姜静颖 ,邢殿楼 ,王斌 ,等. 池塘养殖中华绒螯蟹幼蟹的 一种球状病毒粒子的电镜观察[J ] . 大连水产学院学报 , 1996 , 11 (1) :51 - 53. [2 ] 陆宏达 ,范丽萍 ,薛美. 中华绒螯蟹小核糖核酸病毒病及 其组织病理学[J ] . 水产学报 , 1999 , 23 (1) :61 - 68. [3 ] 沈锦玉 ,尹文林 ,钱冬 ,等. 中华绒螯蟹“腹水病”及“抖抖 病”并发病病原的研究[J ] . 中国水产科学 ,2000 , 7 (3) :89 - 92. [4 ] Fletcher TC. Non2specific defense mechanisms of fish [ J ] . Developmental and Cooparative Immunology Suppl , 1982 ,10 (2) :123 - 132. [5 ] 吴志新 ,陈强 ,陈昌福. 左旋咪唑对异育银鲫免疫促进作 用的初步研究[J ] . 华中农业大学学报 ,1998 , 17 (4) :378 - 381. [6 ] 王雷 ,李光友 ,毛远兴 ,等. 口服免疫型药物对养殖中国 对虾病害防治作用的研究[J ] . 海洋与湖沼 ,1994 , 25 (5) : 486 - 491. [7 ] 刘恒 ,李光友. 免疫多糖对养殖南美白对虾作用的研究 [J ] . 海洋与湖沼 ,1998 , 29(2) :113 - 117. [8 ] 庄承纪 ,刘劲科 ,杨清友 ,等. 壳多糖对罗氏沼虾、斑节对 虾苗生长和抗菌防病作用研究[J ] . 湛江海洋大学学报 , 1998 , 18 (3) : 29 - 34. [9 ] Hultmark D. Insect immuneity : purifyication and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of im2 muneized pupae of Hyalophera cecropia. Eur J Biochem , 1980 ,106 :7 - 16. [10 ] 邓碧玉 ,袁勤 ,李文杰 ,等. 改良后的连苯三酚自氧化测 定超氧化物歧化酶活性的方法[J ] . 生物化学与生物物 理进展 ,1991 ,18(2) :163 - 165. [11 ] 周德庆 ,李晓川 ,李兆新 ,等. 无公害食品 水产品中渔药 残留限量[J ] . 中华人民共和国农业行业标准 (NY 5070 - 2002) ,2002 , 361 - 369. [12 ] Di Luzio NR. Immunopharmacology of glucan : a broad spec2 trum enhancer of host defence mechanisms [ J ] . Trends Pharmacol Sci , 1983 ,4 :344 - 347. [13 ] Sakai M , Atsuta S , Kobayashi M. The activation of leucocytes in rainbow trout , Oncorhynchus mykiss , by oral administration of Clostridium butyricum bacterin[A] . Shariff JR , Subasinghe RP. Diseases in Asian Aquaculture Ⅱ[ C ] . Manila : Fish Health Section , Asian Fisheries Society ,1995. 427 - 431. [14 ] Sung HH , Song YL , Kou GH. Potential uses of bacterin to prevent shrimp vibriosis[J ] . Fish Shellfish Immunol , 1991 , 1 : 311 - 312. (责任编辑 袁醉敏) 沈锦玉等 :免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫功能的影响 · 92 · © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net