《生物资源》：肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展（唐冬生、詹群美、魏妍妍、朱向星）

生物资源2019.41(6):486~493 Biotic resources DOI:10.14188/ajsh.2019.06.002 肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展 唐冬生,詹群美「,魏妍妍,朱向星 (佛山科学技术学院广东省动物分子设计与精准育种重点实验室/广东省基因编辑工程技术研究中心 广东佛山528225) 摘要:肌肉生成抑制素( myostatin,MSTN)在动物机体骨骼肌的增殖、分化和生长中起着重要的负调控作用。MSTN基 因的过表达会阻碍骨骼肌增殖分化及生长发育,而缺失或表达降低则会导致肌肉肥大,形成双肌现象( double muscle phenomenon,DMP)。MsTN能作用于多个基因及结合多种细胞因子广泛参与生理生化、物质代谢、病理调控等过程,在动物 机体生长发育过程中扮演着重要的角色。本文将从MSTN基因的历史渊源、基因定位、时空表达特性、部分相关作用机制等方 面进行论述,旨在对MSTN调控动物骨骼肌生长部分机制作梳理,以期为后期研究提供理论依据。 关键词:骨骼肌;肌肉生成抑制素;生长发育;作用机制 中图分类号:S814.8 文献标识码:A 文章编号:2096-3491(2019)06-0486-08 Advances in regulatory mechanism of myostatin on animal skeletal muscle wth TANG Dongsheng, ZHAN Qunmei WEI Yanyan, ZHU Xiangxing Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precise Breeding/Guangdong Provincial Research Center of Gene Editing Engineering Technology, Foshan University, Foshan. 528225, Guangdong, China) Abstract: Myostatin(MSTN) is a negative regulation factor of skeletal muscle growth and development in animals Overexpression of MsTN gene will hinder the proliferation, differentiation, growth and development of skeletal muscle while lack or reduced expression of Mstn gene will lead to muscle hypertrophy and the formation of double muscle phe nomenon(DMP). MSTN can play an important role in the growth and development of animals by acting on multiple genes and combining with a variety of cytokines to participate in physiological, biochemical, material metabolism, patho- logical regulation and other processes. This review discusses the historical origin of MSTN gene, gene localization, spatio- temporal expression characteristics, and some relevant mechanisms, aiming to sort out some mechanisms of MStn regu lating skeletal muscle growth in animals, so as to provide theoretical basis for later research Key words: skeletal muscle: myostatin; growth and development; action mechanism 位。骨骼肌在生长发育过程中受到复杂的生理信号 0引言 通路及细胞因子等调控,肌肉生长抑制素(myo- 作为脊椎动物机体内最丰富的组织,骨骼肌的 statin,MSTN)就是其中一个重要因子。MSTN在 正常生长发育在动物机体发育过程中占据着重要地骨骼肌增殖、分化和生长发育过程中起着负调控作 收稿日期:201909-05修回日期:2019-10-18接受日期:2019-11-1 作者简介:唐冬生(1962-),男,教授,博士,研究方向:动物分子遗传与育种。E-mal:tangos@163.com;詹群美(1994-),男,硕士生,研究方向 动物分子遗传与育种。E-mail:quzhang@outlook.com。唐冬生、詹群美对本研究有同等贡献,为本文共同第一作者 基金项目:国家科技重大专项(2014ZX0801012B;2018ZX08010-08B)、广东省重点领域研发计划(2018B02020303)、佛山市科技创新项目计 划(2017AG100111)和广东省动物分子设计与精准育种重点实验室开放课题(2018A05) 3IH#x: Tang D S. Zhan QM. Wei Y Y, et al. Advances in regulatory mechanism of myostatin on animal skeletal muscle growth [J].Bi Resources,2019,41(6):486-493. 唐冬生,詹群美,魏妍妍,等.肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展[].生物资源,2019,41(6):486-493

生物资源 2019，41（6）：486~493 Biotic Resources 肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展 唐冬生†，詹群美†，魏妍妍，朱向星 （佛山科学技术学院 广东省动物分子设计与精准育种重点实验室/广东省基因编辑工程技术研究中心， 广东 佛山 528225） 摘要：肌肉生成抑制素（myostatin，MSTN）在动物机体骨骼肌的增殖、分化和生长中起着重要的负调控作用。MSTN 基 因 的 过 表 达 会 阻 碍 骨 骼 肌 增 殖 分 化 及 生 长 发 育 ，而 缺 失 或 表 达 降 低 则 会 导 致 肌 肉 肥 大 ，形 成 双 肌 现 象（double muscle phenomenon，DMP）。MSTN 能作用于多个基因及结合多种细胞因子广泛参与生理生化、物质代谢、病理调控等过程，在动物 机体生长发育过程中扮演着重要的角色。本文将从 MSTN 基因的历史渊源、基因定位、时空表达特性、部分相关作用机制等方 面进行论述，旨在对 MSTN 调控动物骨骼肌生长部分机制作梳理，以期为后期研究提供理论依据。 关键词：骨骼肌；肌肉生成抑制素；生长发育；作用机制 中图分类号：S814. 8 文献标识码：A 文章编号：2096⁃3491（2019）06⁃0486⁃08 Advances in regulatory mechanism of myostatin on animal skeletal muscle growth TANG Dongsheng†，ZHAN Qunmei†，WEI Yanyan，ZHU Xiangxing （Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precise Breeding/Guangdong Provincial Research Center of Gene Editing Engineering Technology，Foshan University，Foshan，528225，Guangdong，China） Abstract：Myostatin（MSTN）is a negative regulation factor of skeletal muscle growth and development in animals. Overexpression of MSTN gene will hinder the proliferation，differentiation，growth and development of skeletal muscle， while lack or reduced expression of MSTN gene will lead to muscle hypertrophy and the formation of double muscle phe⁃ nomenon（DMP）. MSTN can play an important role in the growth and development of animals by acting on multiple genes and combining with a variety of cytokines to participate in physiological，biochemical，material metabolism，patho⁃ logical regulation and other processes. This review discusses the historical origin of MSTN gene，gene localization，spatio⁃ temporal expression characteristics，and some relevant mechanisms，aiming to sort out some mechanisms of MSTN regu⁃ lating skeletal muscle growth in animals，so as to provide theoretical basis for later research. Key words：skeletal muscle；myostatin；growth and development；action mechanism 0 引 言 作为脊椎动物机体内最丰富的组织，骨骼肌的 正常生长发育在动物机体发育过程中占据着重要地 位。骨骼肌在生长发育过程中受到复杂的生理信号 通 路 及 细 胞 因 子 等 调 控 ，肌 肉 生 长 抑 制 素（myo⁃ statin，MSTN）就是其中一个重要因子。MSTN 在 骨骼肌增殖、分化和生长发育过程中起着负调控作 DOI：10. 14188/j. ajsh. 2019. 06. 002 收稿日期：2019⁃09⁃05 修回日期：2019⁃10⁃18 接受日期：2019⁃11⁃12 作者简介：唐冬生（1962⁃），男，教授，博士，研究方向：动物分子遗传与育种。E⁃mail：tangdsh@163. com；詹群美（1994⁃），男，硕士生，研究方向： 动物分子遗传与育种。E⁃mail：qmzhan@outlook. com。唐冬生、詹群美对本研究有同等贡献，为本文共同第一作者 基金项目：国家科技重大专项（2014ZX0801012B；2018ZX08010⁃08B）、广东省重点领域研发计划（2018B020203003）、佛山市科技创新项目计 划（2017AG100111）和广东省动物分子设计与精准育种重点实验室开放课题（2018A05） 引用格式：Tang D S，Zhan Q M，Wei Y Y，et al. Advances in regulatory mechanism of myostatin on animal skeletal muscle growth［J］. Biotic Resources，2019，41（6）：486⁃493. 唐冬生，詹群美，魏妍妍，等 . 肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展［J］. 生物资源，2019，41（6）：486⁃493

生物资源 用,MSTN基因的过表达会阻碍动物机体骨骼肌的MSTN基因定位也已完成。MSTN基因序列在不 生长,部分、完全缺失或表达降低均会导致动物机同物种间高度保守。克隆人、小鼠、牛、猪、羊、鸡和 体出现双肌现象( double muscle phenomenon,斑马鱼MSTN基因cDNA序列表明,就C-tjp而言 DMP)2。DMP在比利时蓝牛( Belgian blue cat-人、小鼠、大鼠、猪和鸡的同源性为100%,牛和绵羊 tle)、皮埃蒙特牛( Piedmontese cattle)和英国惠比仅相差1~3个碱基,而斑马鱼与小鼠同源性为 特犬( British whippet)4等物种中表现突出,这正是88%。将比利时蓝牛和皮埃蒙特牛MSTN基因 MSTN基因部分或完全缺失形成的表型(图1)。CDNA与正常牛基因进行序列分析对照,结果表明 MSTN基因不仅广泛参与物质代谢过程,而且在胰在比利时蓝牛中MSTN基因外显子3中存在11b 岛素耐受的调控等生命过程中起着重要作用,此的纯合性缺失,提前终止了开放阅读框( open read 外在肌肉萎缩(2、营养性肌发育不良等耗竭型疾病 ing frame,ORF),导致位于MSTN生物学效应区的 病理过程中也扮演着重要角色。利用以上特点结合部分氨基酸片段缺失,丧失抑制肌肉增殖、分化及生 现代分子生物学技术对经济动物的MSTN基因进长发育的生物功能,因而比利时蓝牛表现DMP;与 行突变或缺失,可使动物机体产生更多的肌肉产品比利时蓝牛不同,皮埃蒙特牛的外显子1和外显子3 而供人类食用;对MSTN基因引起的耗竭型疾病中各有一处突变,即外显子1中一处C核苷酸突变 的相关作用机制进行深入研究,能提高对人类该类为A核苷酸,导致位于第94位苯丙氨酸(Phe)被亮 疾病的防治效率。因此,对MSTN基因的作用机制氨酸(Leu)所取代。而外显子3中一G核苷酸突变 进行深入研究,不论是在动物疾病模型构建领域,还为A核苷酸,导致第313位半胱氨酸(Cys)替换为色 是在动物经济性状改良方面,都有重要意义。 氨酸(Tp)(图2)。两处氨基酸的替换正好位于 MSTN生物学效应区,一处或两处替换均能导致 1MSTN基因特征及其表达特性 MSTN生物学作用部分或者完全丧失,从而导致皮 1.1MSTN的发现 埃蒙特牛出现DMP。 1997年, McPherron与Lee等人在小鼠CDNA1.3MSTN基因mRNA表达特性 文库中首次克隆MSTN基因,经研究发现,该基因 早期试验证明MSTN基因在小鼠胚胎发育早 经转录翻译形成的蛋白具有转化生长因子超家族期的表达局限于肌节区,而在成年个体中,MSTN基 ( trans forming growth factor beta,TGFP)成员典型因主要在骨骼肌中表达。对处于生长发育期的猪 结构,因此将其命名为转化生长因子-8( transform-的不同组织中MSTN基因mRNA进行检测发现 ing growth factor8,TGF-8),鉴于其特殊的生理功MSTN基因mRNA存在于在骨骼肌、脂肪组织、心 能,亦称其为肌肉生长抑制素或肌抑素( myostatin),肌、肝脏及肾脏中,其中骨骼肌中表达量最高,其他 即MSTN。 组织相对较低;进一步研究表明,MSTN基因在哺乳 1.2MSTN基因染色体定位与序列特性 动物脑组织、淋巴组织、胎盘组织、内膜细胞均有表 精确的基因定位是研究基因功能的前提。目达。鱼类体内MSTN基因表达更为广泛,骨骼 前,多个物种MSTN基因定位已经完成,例如猪肌、鳃、肠、大脑、眼、性腺均能检测到MSTN基因 MSTN基因定位于15号染色体15q2.30;牛的定位mRNA。此外,MSTN基因mRNA含量随着年龄 于2号染色体端粒区域2q14-q15;绵羊的定位于2的增长而变化,从胚胎时期到老年时期呈现先升高 号染色体端粒区域;鸡的定位于7号染色体等。后降低、再升高的趋势。MSTN在动物机体生长 此外,小鼠、大鼠、家兔、斑马鱼和狒狒等不同物种的发育过程中,在各个组织器官的形成、发育、功能发 图1.比利时蓝牛、皮埃蒙特牛和英国惠比特犬双肌表型 Fig1 Belgian blue cattle, Piedmontese cattle and British wh double muscle phenotypes

生物资源 用，MSTN 基因的过表达会阻碍动物机体骨骼肌的 生长，部分、完全缺失或表达降低均会导致动物机 体 出 现 双 肌 现 象（double muscle phenomenon， DMP）［1，2］。 DMP 在 比 利 时 蓝 牛（Belgian blue cat⁃ tle）、皮埃蒙特牛（Piedmontese cattle）［3］ 和英国惠比 特犬（British whippet）［4］ 等物种中表现突出，这正是 MSTN 基 因 部 分 或 完 全 缺 失 形 成 的 表 型（图 1）。 MSTN 基因不仅广泛参与物质代谢过程，而且在胰 岛素耐受的调控等生命过程中起着重要作用［5］ ，此 外在肌肉萎缩［2］ 、营养性肌发育不良［6］ 等耗竭型疾病 病理过程中也扮演着重要角色。利用以上特点结合 现代分子生物学技术对经济动物的 MSTN 基因进 行突变或缺失，可使动物机体产生更多的肌肉产品 而供人类食用［7］ ；对 MSTN 基因引起的耗竭型疾病 的相关作用机制进行深入研究，能提高对人类该类 疾病的防治效率。因此，对 MSTN 基因的作用机制 进行深入研究，不论是在动物疾病模型构建领域，还 是在动物经济性状改良方面，都有重要意义。 1 MSTN 基因特征及其表达特性 1. 1 MSTN 的发现 1997 年 ，McPherron 与 Lee 等 人 在 小 鼠 cDNA 文库中首次克隆 MSTN 基因，经研究发现，该基因 经转录翻译形成的蛋白具有转化生长因子⁃β 超家族 （transforming growth factor beta，TGF ⁃β）成员典型 结构，因此将其命名为转化生长因子⁃8（transform⁃ ing growth factor 8，TGF ⁃8），鉴于其特殊的生理功 能，亦称其为肌肉生长抑制素或肌抑素（myostatin）， 即 MSTN［8］ 。 1. 2 MSTN 基因染色体定位与序列特性 精确的基因定位是研究基因功能的前提。目 前 ，多 个 物 种 MSTN 基 因 定 位 已 经 完 成 ，例 如 猪 MSTN 基因定位于 15 号染色体 15q2. 3 ［9］ ；牛的定位 于 2 号染色体端粒区域 2q14⁃q15［10］ ；绵羊的定位于 2 号染色体端粒区域［11］ ；鸡的定位于 7 号染色体［12］ 等。 此外，小鼠、大鼠、家兔、斑马鱼和狒狒等不同物种的 MSTN 基因定位也已完成。MSTN 基因序列在不 同物种间高度保守。克隆人、小鼠、牛、猪、羊、鸡和 斑马鱼 MSTN 基因 cDNA 序列表明，就 C ⁃tip 而言， 人、小鼠、大鼠、猪和鸡的同源性为 100%，牛和绵羊 仅 相 差 1~3 个 碱 基 ，而 斑 马 鱼 与 小 鼠 同 源 性 为 88%［13］ 。将比利时蓝牛和皮埃蒙特牛 MSTN 基因 cDNA 与正常牛基因进行序列分析对照，结果表明， 在比利时蓝牛中 MSTN 基因外显子 3 中存在 11 bp 的纯合性缺失，提前终止了开放阅读框（open read⁃ ing frame，ORF），导致位于 MSTN 生物学效应区的 部分氨基酸片段缺失，丧失抑制肌肉增殖、分化及生 长发育的生物功能，因而比利时蓝牛表现 DMP；与 比利时蓝牛不同，皮埃蒙特牛的外显子 1 和外显子 3 中各有一处突变，即外显子 1 中一处 C 核苷酸突变 为 A 核苷酸，导致位于第 94 位苯丙氨酸（Phe）被亮 氨酸（Leu）所取代。而外显子 3 中一 G 核苷酸突变 为 A 核苷酸，导致第 313 位半胱氨酸（Cys）替换为色 氨 酸（Trp）（图 2）。 两 处 氨 基 酸 的 替 换 正 好 位 于 MSTN 生物学效应区 ，一处或两处替换均能导致 MSTN 生物学作用部分或者完全丧失，从而导致皮 埃蒙特牛出现 DMP［14~16］ 。 1. 3 MSTN 基因 mRNA 表达特性 早期试验证明 MSTN 基因在小鼠胚胎发育早 期的表达局限于肌节区，而在成年个体中，MSTN 基 因主要在骨骼肌中表达［9］ 。对处于生长发育期的猪 的不同组织中 MSTN 基因 mRNA 进行检测发现， MSTN 基因 mRNA 存在于在骨骼肌、脂肪组织、心 肌、肝脏及肾脏中，其中骨骼肌中表达量最高，其他 组织相对较低；进一步研究表明，MSTN 基因在哺乳 动物脑组织、淋巴组织、胎盘组织、内膜细胞均有表 达［17］。 鱼 类 体 内 MSTN 基 因 表 达 更 为 广 泛 ，骨 骼 肌、鳃、肠、大脑、眼、性腺均能检测到 MSTN 基因 mRNA［18］ 。此外，MSTN 基因 mRNA 含量随着年龄 的增长而变化，从胚胎时期到老年时期呈现先升高、 后降低、再升高的趋势［19］ 。MSTN 在动物机体生长 发育过程中，在各个组织器官的形成、发育、功能发 图 1. 比利时蓝牛、皮埃蒙特牛［3］ 和英国惠比特犬［4］ 双肌表型 Fig. 1 Belgian blue cattle，Piedmontese cattle［3］ and British whippet［4］ double muscle phenotypes · 487 ·

唐冬生等:肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展 挥及生命历程等方面都存在着重要作用,但是其具发育相关的多个信号通路存在联系,尤其与细胞周 体相关性、作用机制有待进一步研究。 期、 SMADS家族、MRFs家族、ActR家族等联系密 4MSTN蛋白表达及功能形成 切,并且MSTN在脂肪沉积等生理过程中也扮演 MSTN蛋白由肌细胞等组织和器官合成、加工着重要的角色。 并释放,属于具有TGF-β超家族蛋白典型分子结构2.1MSTN与骨骼肌细胞周期共同调控骨骼肌 特征的自分泌或旁分泌蛋白,由376个氨基酸组成增殖分化及生长发育 (图2)。MSTN前体蛋白核心主要由N-tip附近的 MSTN主要调节肌细胞从G1期到S期及从G2 氨基酸残基构成,以连续相同氨基酸序列作为分泌期到M期转变。作为细胞周期调控机制的核心 信号;前体蛋白C附近,存在蛋白水解酶识别位胞周期蛋白依赖性激酶( cyclin dependent kinase, 点和半胱氨酸核心结构( Cys knot结构),MSTN通CDK)是关于细胞周期能否顺利完成从G1~S期过 过 Cys knot结构形成二硫键,折叠形成具有生物学渡到G2~M期的限速酶。MSTN能够降低2型 活性的二聚体,即成熟MSTN蛋白。N-ip前导肽、CDK(CDK2)的表达量,从而导致周期蛋白依赖激 N-印信号肽及C-成熟肽三者共同组装形成酶抑制因子p2l的表达量增加,使得细胞周期蛋白 MSTN前体蛋白,其中,N-ip信号肽主要执行细胞复合物 CyclinE-CDK2含量减少并且活性降低,进而 将MsTN蛋白自行分泌到细胞外的功能。 MSTN视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Rb蛋白)的磷酸化 成熟蛋白形成前,需要进行两次水解,第一次水解位过程被抑制,最终MSTN行使抑制肌细胞增殖分化 于细胞内,主要去掉具有结合能力的C片段,第的生物学作用,使肌细胞分裂停滞在G1期,不能进 次水解位于细胞外,主要去掉N-ip信号肽序列 步增殖分化;分泌到胞外的MSTN前体蛋白迅速 此后,两个MSTN成熟蛋白在 Cys knot结构上以二水解形成活性二聚体,及时与MSTN受体结合,从 硫键的形式结合,形成MSTN成熟蛋白二聚体,经而激活 SMADS与P38MAPK等信号通路,使抑制 过进一步生化修饰过程后,形成具有真正生物学活因子p21的转录增强,p21与 CyclinE-CDK2复合物 性的MSTN蛋白,在其与特异性受体结合后,执行结合使其失活,从而达到对肌细胞周期从G1~S期 相应的生物学作用。MSTN蛋白形成是一个复过渡到G2~M期的抑制作用2。 杂的调控过程,此过程中将受到多种细胞因子的调2.2MSTN与 SMADS蛋白家族结合负调控肌 控,其具体调控途径及作用机制有待进一步硏究。細胞的増殖分化及生长发育 SMADS蛋白家族是目前唯一被发现的TGFB 2MSTN作用机制研究进展 超家族信号转导受体底物。 SMADS蛋白一方面通 机体骨骼肌的生长发育受环境、基因等因素的过磷酸化形成蛋白信号通道,可将TGFB信号由细 影响,基因的特异性表达及细胞因子与受体间特异胞膜外传递至细胞核内,另一方面可进入细胞核找 性结合相互促进、相互制约,构成复杂网络促进或抑到TGF靶点并与之互作,从而激活或抑制靶基因 制骨骼肌的生长发育(图3)。MSTN与骨骼肌生长的表达,达到TGFB超家族介导的对细胞的各种调 PRO-REION PSSR ACTIVE-PEPTIDE 001-060 MQKLQIYVYI YLFMLIVAGP VDLNCNSEQK CNVCKCGLCN ACMWRQNTKS SRLCAIKIQI 061-120 LSKLRLCTAP NSKDAIRQL LPKAPPLREL IDQYDVQRDD SSDGSLEDDD YHATTETIIT 121-180 MPTESDLLMQ VEGKPKCCFF KFSSKIQYNK VVKAQLWIYL RPVKTPTTVF VQILRLIKPM 181-240 KDGTRYTGTR SLKLDMNPGT GTWQSTDVKT VLQNWLKQPE SNLGIETKAL DENGHIDLAVT 211-300 FPGPGEDGLN PFLEVKVTDT PKRSRRDEGL DEDEHSTESR CCRYPLTVDF CAFGWDWIIA 301-360 PKRYKANYCS GCCCFVFLQK YPHTHLVHQA NPRGSAGPCC TPLKMSPINM LYFNGKEQII 361-376 YGKIPAMVVD RCGCS 图2MSTN蛋白结构及氨基酸序列 Fig. 2 Structure and amino acid sequence of MstN protein

唐冬生 等：肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展 挥及生命历程等方面都存在着重要作用，但是其具 体相关性、作用机制有待进一步研究。 1. 4 MSTN 蛋白表达及功能形成 MSTN 蛋白由肌细胞等组织和器官合成、加工 并释放，属于具有 TGF⁃β 超家族蛋白典型分子结构 特征的自分泌或旁分泌蛋白，由 376 个氨基酸组成 （图 2）。MSTN 前体蛋白核心主要由 N ⁃tip 附近的 氨基酸残基构成，以连续相同氨基酸序列作为分泌 信号；前体蛋白 C ⁃tip 附近，存在蛋白水解酶识别位 点和半胱氨酸核心结构（Cys knot 结构），MSTN 通 过 Cys knot 结构形成二硫键，折叠形成具有生物学 活性的二聚体，即成熟 MSTN 蛋白。N ⁃tip 前导肽、 N ⁃ tip 信 号 肽 及 C ⁃ tip 成 熟 肽 三 者 共 同 组 装 形 成 MSTN 前体蛋白，其中，N ⁃tip 信号肽主要执行细胞 将 MSTN 蛋白自行分泌到细胞外的功能。MSTN 成熟蛋白形成前，需要进行两次水解，第一次水解位 于细胞内，主要去掉具有结合能力的 C ⁃tip 片段，第 二次水解位于细胞外，主要去掉 N ⁃tip 信号肽序列， 此后，两个 MSTN 成熟蛋白在 Cys knot 结构上以二 硫键的形式结合，形成 MSTN 成熟蛋白二聚体，经 过进一步生化修饰过程后，形成具有真正生物学活 性的 MSTN 蛋白，在其与特异性受体结合后，执行 相应的生物学作用［9，20］ 。MSTN 蛋白形成是一个复 杂的调控过程，此过程中将受到多种细胞因子的调 控，其具体调控途径及作用机制有待进一步研究。 2 MSTN 作用机制研究进展 机体骨骼肌的生长发育受环境、基因等因素的 影响，基因的特异性表达及细胞因子与受体间特异 性结合相互促进、相互制约，构成复杂网络促进或抑 制骨骼肌的生长发育（图 3）。MSTN 与骨骼肌生长 发育相关的多个信号通路存在联系，尤其与细胞周 期、SMADS 家族、MRFs 家族、ActR 家族等联系密 切，并且 MSTN 在脂肪沉积［53］ 等生理过程中也扮演 着重要的角色。 2. 1 MSTN 与骨骼肌细胞周期共同调控骨骼肌 增殖分化及生长发育 MSTN 主要调节肌细胞从 G1 期到 S 期及从 G2 期到 M 期转变。作为细胞周期调控机制的核心，细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶（cyclin dependent kinase， CDK）是关于细胞周期能否顺利完成从 G1~S 期过 渡到 G2~M 期的限速酶［21］ 。MSTN 能够降低 2 型 CDK（CDK2）的表达量，从而导致周期蛋白依赖激 酶抑制因子 p21 的表达量增加，使得细胞周期蛋白 复合物 CyclinE⁃CDK2 含量减少并且活性降低，进而 视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（Rb 蛋白）的磷酸化 过程被抑制，最终 MSTN 行使抑制肌细胞增殖分化 的生物学作用，使肌细胞分裂停滞在 G1 期，不能进 一步增殖分化；分泌到胞外的 MSTN 前体蛋白迅速 水解形成活性二聚体，及时与 MSTN 受体结合，从 而激活 SMADS 与 P38MAPK 等信号通路，使抑制 因子 p21 的转录增强，p21 与 CyclinE ⁃CDK2 复合物 结合使其失活，从而达到对肌细胞周期从 G1~S 期 过渡到 G2~M 期的抑制作用［22］ 。 2. 2 MSTN 与 SMADS 蛋白家族结合负调控肌 细胞的增殖分化及生长发育 SMADS 蛋白家族是目前唯一被发现的 TGF⁃β 超家族信号转导受体底物。SMADS 蛋白一方面通 过磷酸化形成蛋白信号通道，可将 TGF⁃β 信号由细 胞膜外传递至细胞核内，另一方面可进入细胞核找 到 TGF⁃β 靶点并与之互作，从而激活或抑制靶基因 的表达，达到 TGF⁃β 超家族介导的对细胞的各种调 图 2 MSTN 蛋白结构及氨基酸序列 Fig. 2 Structure and amino acid sequence of MSTN protein · 488 ·

生物资源 Gl-S期、G2M期 i Cyclin-CDK 活化复合体 SMAD2/3 MSTN Pro-MSTN MyoD(+), Myf5(+) Myoblasts Proliferation 图3MSTN基因表达相关部分调控网络 Fig3 MSTN gene expression related part of the regulatory network 控作用的目的。研究表明,MSTN基因的启动子在着与 ActrIIB受体相关的其他信号通路,在骨骼 可以与受调控 SMADS蛋白( regulated SMADS pro-肌的增殖分化与生长发育中共同作用,其作用机制 tein,R- SMADS,如SMAD2、SMAD3等)及公共有待进一步研究7 SMADS蛋白( common SMADS protein,Co-2.4MSTN与FoxO在肌肉生长发育中起着重 SMADS,如SMAD4等)相结合,三者均可提高要的调控作用 MSTN基因启动子的活性,从而使得MSTN基因 叉头转录因子( forkhead box transcription fac- mRNA的表达量显著增加,进而增强MSTN对骨骼tor,FoxO)是一类关键的细胞增殖分化调控因子 肌细胞增殖分化及生长发育的抑制作用。由此推广泛参与细胞增殖分化等重要的生理生化过程。 测,MSTN基因对骨骼肌生长发育的调控作用很可FoxO主要通过胰岛素样生成因子磷脂酰肌醇3激 能是通过 SMADS调节MSTN靶基因来实现酶-叉头转录因子(IGF/PI3K/FoxO)信号通路的作 的写。进一步研究发现,MSTN基因mRNA的表用来调控肌肉增殖分化与生长发育。作为IGF/ 达与SMAD3和SMAD4的含量呈正相关,推测PI3K/FoxO信号通路的关键因子,FoxO活性受 SMAD3对MSTN基因有正调控作用。目前,R-IGF-1调控,IGF可以与细胞表面受体结合进而激 SMADS蛋白与MSTN基因表达相关的研究比较欠活PI3K/Akt通路,对FoxO活性产生抑制作用。 缺,其调控作用机制有待进一步研究:。 研究表明,MSTN可以抑制Akt磷酸化过程,进而 2.3MSTN与ActR蛋白家族在骨骼肌的增殖FoxO活性升高,达到抑制肌肉细胞正常生长发育作 分化与生长发育中共同作用 用。另外,FoxO可通过与MSTN启动子Ebox序 激活素受体( activin receptor,ActR)蛋白属于列区域结合,使MSTN表达量上调,从面抑制肌遗 TGFB超家族丝氨酸苏氨酸蛋白激酶型受体,在动传因子( myogenic determining factor,MyoD)表达 物机体细胞分化等生理过程中发挥着重要作用。根降低肌酸激酶等参与肌肉增殖分化、生长发育相关 据结构和功能主要分为1型受体( AcrI)和Ⅱ1型受调控基因的表达量,达到抑制肌肉细胞分化的目 体(ActR),ActRⅡ又可分为 ActrIIa和 ActRIIB的。因此,FoxO和MSTN在肌肉生长发育通 两个亚型,研究表明, ActRIIB与MSTN的结合能力路中起着重要的调控和关联作用。 明显高于 ActRIIA,由此推测,研究 ActRAl在介导2.5MSTN负调控MRFs蛋白家族表达而抑制 MSTN发挥肌肉生长抑制作用过程可能更具有意机体骨骼肌生成 义。将可溶性 ActrIIB蛋白注射到野生小鼠体内两 生肌调控因子( myogenic regulatory factors, 周后,发现小鼠肌肉增重60%MSTN蛋白含量显MRFs)蛋白家族主要由MyoD、肌源蛋白(myo 著下降,且相同条件下,肌肉增重量明显高于 MSTN genin,MyoG)等因子组成,促进骨骼肌干细胞和卫 基因突变小鼠,推测 ActRIIB不仅对MSTN基因的星细胞向成肌细胞分化,并融合形成肌纤维。该家 表达存在明显的抑制作用,而且在动物机体内还存族成员均含有螺旋-环-螺旋( basic helix- loop-helix

生物资源 控作用的目的［23］ 。研究表明，MSTN 基因的启动子 可以与受调控 SMADS 蛋白（regulated SMADS pro⁃ tein，R ⁃ SMADS，如 SMAD2、SMAD3 等）及 公 共 SMADS 蛋 白 （common SMADS protein，Co ⁃ SMADS，如 SMAD4 等）相 结 合 ，三 者 均 可 提 高 MSTN 基因启动子的活性，从而使得 MSTN 基因 mRNA 的表达量显著增加，进而增强 MSTN 对骨骼 肌细胞增殖分化及生长发育的抑制作用。由此推 测，MSTN 基因对骨骼肌生长发育的调控作用很可 能 是 通 过 SMADS 调 节 MSTN 靶 基 因 来 实 现 的［24，25］ 。进一步研究发现，MSTN 基因 mRNA 的表 达 与 SMAD3 和 SMAD4 的 含 量 呈 正 相 关 ，推 测 SMAD3 对 MSTN 基 因 有 正 调 控 作 用 。 目 前 ，R ⁃ SMADS 蛋白与 MSTN 基因表达相关的研究比较欠 缺，其调控作用机制有待进一步研究［24，26］ 。 2. 3 MSTN 与 ActR 蛋白家族在骨骼肌的增殖 分化与生长发育中共同作用 激 活 素 受 体（activin receptor，ActR）蛋 白 属 于 TGF⁃β 超家族丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶型受体，在动 物机体细胞分化等生理过程中发挥着重要作用。根 据结构和功能主要分为 I 型受体（ActRI）和 II 型受 体（ActRII），ActRII 又 可 分 为 ActRIIA 和 ActRIIB 两个亚型，研究表明，ActRIIB 与 MSTN 的结合能力 明显高于 ActRIIA，由此推测，研究 ActRIIB 在介导 MSTN 发挥肌肉生长抑制作用过程可能更具有意 义。将可溶性 ActRIIB 蛋白注射到野生小鼠体内两 周后，发现小鼠肌肉增重 60%，MSTN 蛋白含量显 著下降，且相同条件下，肌肉增重量明显高于 MSTN 基因突变小鼠，推测 ActRIIB 不仅对 MSTN 基因的 表达存在明显的抑制作用，而且在动物机体内还存 在着与 ActRIIB 受体相关的其他信号通路，在骨骼 肌的增殖分化与生长发育中共同作用，其作用机制 有待进一步研究［27，28］ 。 2. 4 MSTN 与 FoxO 在肌肉生长发育中起着重 要的调控作用 叉 头 转 录 因 子（forkhead box transcription fac⁃ tor，FoxO）是一类关键的细胞增殖分化调控因子， 广泛参与细胞增殖分化等重要的生理生化过程 。 FoxO 主要通过胰岛素样生成因子⁃磷脂酰肌醇 3 激 酶⁃叉头转录因子（IGF/PI3K/FoxO）信号通路的作 用 来 调 控 肌 肉 增 殖 分 化 与 生 长 发 育 。 作 为 IGF/ PI3K/FoxO 信 号 通 路 的 关 键 因 子 ，FoxO 活 性 受 IGF⁃I 调控，IGF⁃I 可以与细胞表面受体结合进而激 活 PI3K/Akt通路，对 FoxO 活性产生抑制作用［29，30］ 。 研究表明，MSTN 可以抑制 Akt 磷酸化过程，进而 FoxO 活性升高，达到抑制肌肉细胞正常生长发育作 用［31］ 。另外，FoxO 可通过与 MSTN 启动子 E⁃box 序 列区域结合，使 MSTN 表达量上调，从而抑制肌遗 传因子（myogenic determining factor，MyoD）表达， 降低肌酸激酶等参与肌肉增殖分化、生长发育相关 调控基因的表达量 ，达到抑制肌肉细胞分化的目 的［32~34］ 。因此，FoxO 和 MSTN 在肌肉生长发育通 路中起着重要的调控和关联作用。 2. 5 MSTN 负调控 MRFs 蛋白家族表达而抑制 机体骨骼肌生成 生 肌 调 控 因 子（myogenic regularory factors， MRFs）蛋 白 家 族 主 要 由 MyoD、肌 源 蛋 白（myo⁃ genin，MyoG）等因子组成，促进骨骼肌干细胞和卫 星细胞向成肌细胞分化，并融合形成肌纤维。该家 族成员均含有螺旋⁃环⁃螺旋（basic helix ⁃loop ⁃helix， 图 3 MSTN 基因表达相关部分调控网络 Fig. 3 MSTN gene expression related part of the regulatory network · 489 ·

490 唐冬生等:肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展 BHLH)结构。在肌细胞中表达的MSTN基因启表达过程参与骨骼肌的增殖分化与生长发育;在 动子中都有E-box结合序列,MRFs家族的B-HLHC2C12细胞中,MEF2C同时激活其他信号通路,与 结构可与MSTN基因的E-box进行结合以激活MRFS家族等共同调控MSTN基因的表达。由 MSTN基因的启动子。MSTN能通过SMAD3的介此可见,MEF2在MSTN作用过程中起着重要作 导来抑制MyoD和MyoG的活性及其表达。在用,其作用机制有待进一步研究。 MSTN启动子作用过程中发现,MyoD还能激活2.8MSTN减少脂肪沉积 MSTN基因转录功能,参与肌肉的生长发育作用,而 MSTN基因在脂肪组织维持机体物质与能量代 MSTN会抑制MyoD的形成,二者共同调控肌细胞谢过程中起着重要的调控作用。研究表明,在脂肪 的生成过程取决于MSTN基因E-box序列与MRFs细胞增殖分化的不同阶段,MSTN基因存在不同的 蛋白家族bHLH结构的亲和力。因此,MSTN基因作用效应。MSTN在脂肪细胞分化早期,主要作用 对MRFs家族蛋白的表达起负调控作用,从而抑制是诱导前体脂肪细胞增殖分化成为成熟脂肪细胞 骨骼肌增殖分化及生长发育 然而在成熟脂肪细胞形成后,MSTN则主要抑制成 2.6FST与MSTN结合并解除其肌抑作用 熟脂肪细胞向具有生物学作用的脂肪细胞进一步增 卵泡抑制素( follistatin,FST)与肌肉肥大存在殖分化。由此推测,MSTN可调控脂肪细胞的 重要联系,FST促进肌肉生长发育的作用主要是通增殖分化以满足机体能量需要,其作用机制有待进 过阻断MSTN/Smad信号通路来减少MSTN对一步研究。通过MSTN基因敲除小鼠研究发现,除 MyoD的抑制作用,从而促进肌肉的生长发育m-。表现明显DMP外,该小鼠脂肪沉积、血糖血脂水平 FST在动物机体骨骼肌增殖、分化、生长、发育过程都显著低于MSTN-wild小鼠,并能抵抗由高脂饮食 中的生物学作用与MSTN存在明显的拮抗性。与诱导型肥胖,并且能通过AMPK信号通路降低胰岛 MSTN- Mutant小鼠的骨骼肌生长发育情况相反,素抵抗。MSTN基因可以直接作用于脂肪组织,参 FST- Mutant小鼠骨骼肌生长发育极其缓慢。相同与其代谢功能。研究MSTN过表达成年小鼠模型 条件下 FST-Mutant小鼠个体明显小于 FST-wild小发现,小鼠摄取的热量主要向肌肉转化而导致脂肪 鼠,并且小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官明沉积减少,该小鼠表现严重的整体衰竭综合征,肌肉 显发育不全;过表达FST的小鼠骨骼肌生长发育较和脂肪体积都急剧减少,并且MSTN可以通过诱导 快且肌肉质量明显增加,研究发现FST能够与SMAD3磷酸化下调PPAR-γ含量来抑制脂肪形 MSTN直接结合,进而阻止MSTN与其受体结合,成 由此推测,MSTN还可能广泛参与代谢 解除其肌抑作用。在小鼠C2C12细胞中同时表调控。 达FST和MSTN,发现FST与MSTN结合后可抑 制MSTN前体蛋白第二次水解过程,使MSTN前3结语 体蛋白不能形成具有活性的MSTN成熟蛋白,以降 MSTN可以直接或间接参与调控动物机体骨 低MSTN成熟蛋白含量,从而解除MSTN抑制骨骼肌增殖分化及生长发育,并且能结合多种细胞因 骼肌生长发育的作用4。 子广泛参与糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢、胰岛素 家族调控MSTN表达参与骨骼肌的耐受、骨密度调控及雌性哺乳动物生殖调控等生命 增殖分化与生长发育 过程,在肌肉萎缩、营养性肌发育不良、糖尿病、艾滋 肌细胞增强因子-2( myocyte enhancer factor-2,病、心脏衰竭、肾脏衰竭和癌症等耗竭型疾病病理过 MEF2)在脊椎动物中存在MEF2A、MEF2B、程中扮演着重要的角色。因此,MSTN在医学领域 EF2C和MEF2D4个亚型。MEF2家族成员均的地位不容忽视,但是到目前为止,大部分研究集中 含有 SMADS-box结构域,该结构域在提高MSTN于其调控经济动物生长性状改良方面,导致对其作 等肌源性因子互作方面发挥重要作用。MSTN基用机制方面的研究还比较欠缺,更没有形成系统信 因启动子区域存在MEF2结合位点,研究表明,号通路理论。目前随着以 CRISPR/Cas9( clustered MEF2在结合MSTN启动子区域E-box区域后能共 regularly interspaced short palindromic repeats/CRIS 同控制肌纤维分化类型,并且有抑制心肌细胞的增PR- associated proteins9)、BE( base editing)为代表 殖分化的作用,降低心脏质量。MEF2C能增强的基因编辑技术的广泛应用,从而为对MSTN基因 MSTN转录活性,过表达MEF2C后,MSTN启动子进行分子水平操作开辟道路,通过基因编辑技术对 活性显著增强,推测该因子可能通过影响MSTN的MSTN基因进行定点敲除、干扰沉默、基因修饰等操

唐冬生 等：肌肉生长抑制素调控动物骨骼肌生长机制的研究进展 B⁃HLH）结构［35］ 。在肌细胞中表达的 MSTN 基因启 动子中都有 E ⁃box 结合序列，MRFs 家族的 B ⁃HLH 结 构 可 与 MSTN 基 因 的 E ⁃ box 进 行 结 合 以 激 活 MSTN 基因的启动子。MSTN 能通过 SMAD3 的介 导 来 抑 制 MyoD 和 MyoG 的 活 性 及 其 表 达 。 在 MSTN 启 动 子 作 用 过 程 中 发 现 ，MyoD 还 能 激 活 MSTN 基因转录功能，参与肌肉的生长发育作用，而 MSTN 会抑制 MyoD 的形成，二者共同调控肌细胞 的生成过程取决于 MSTN 基因 E⁃box 序列与 MRFs 蛋白家族 bHLH 结构的亲和力。因此，MSTN 基因 对 MRFs 家族蛋白的表达起负调控作用，从而抑制 骨骼肌增殖分化及生长发育［36］ 。 2. 6 FST 与 MSTN 结合并解除其肌抑作用 卵泡抑制素（follistatin，FST）与肌肉肥大存在 重要联系，FST 促进肌肉生长发育的作用主要是通 过 阻 断 MSTN/Smad 信 号 通 路 来 减 少 MSTN 对 MyoD 的抑制作用，从而促进肌肉的生长发育［37~39］ 。 FST 在动物机体骨骼肌增殖、分化、生长、发育过程 中的生物学作用与 MSTN 存在明显的拮抗性。与 MSTN⁃Mutant 小鼠的骨骼肌生长发育情况相反， FST⁃Mutant 小鼠骨骼肌生长发育极其缓慢。相同 条件下 FST⁃Mutant 小鼠个体明显小于 FST⁃wild 小 鼠，并且小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官明 显发育不全；过表达 FST 的小鼠骨骼肌生长发育较 快 且 肌 肉 质 量 明 显 增 加 ，研 究 发 现 FST 能 够 与 MSTN 直接结合，进而阻止 MSTN 与其受体结合， 解除其肌抑作用［40，41］ 。在小鼠 C2C12 细胞中同时表 达 FST 和 MSTN，发现 FST 与 MSTN 结合后可抑 制 MSTN 前体蛋白第二次水解过程，使 MSTN 前 体蛋白不能形成具有活性的 MSTN 成熟蛋白，以降 低 MSTN 成熟蛋白含量，从而解除 MSTN 抑制骨 骼肌生长发育的作用［42，43］ 。 2. 7 MEF2 家族调控 MSTN 表达参与骨骼肌的 增殖分化与生长发育 肌细胞增强因子⁃2（myocyte enhancer factor⁃2， MEF2）在 脊 椎 动 物 中 存 在 MEF2A、MEF2B、 MEF2C 和 MEF2D 4 个亚型［44］ 。MEF2 家族成员均 含有 SMADS ⁃box 结构域，该结构域在提高 MSTN 等肌源性因子互作方面发挥重要作用［45］ 。MSTN 基 因 启 动 子 区 域 存 在 MEF2 结 合 位 点 ，研 究 表 明 ， MEF2 在结合 MSTN 启动子区域 E⁃box 区域后能共 同控制肌纤维分化类型，并且有抑制心肌细胞的增 殖分化的作用，降低心脏质量［46，47］ 。MEF2C 能增强 MSTN 转录活性，过表达 MEF2C 后，MSTN 启动子 活性显著增强，推测该因子可能通过影响 MSTN 的 表达过程参与骨骼肌的增殖分化与生长发育 ；在 C2C12 细胞中，MEF2C 同时激活其他信号通路，与 MRFS 家族等共同调控 MSTN 基因的表达［48］ 。由 此 可 见 ，MEF2 在 MSTN 作 用 过 程 中 起 着 重 要 作 用，其作用机制有待进一步研究。 2. 8 MSTN 减少脂肪沉积 MSTN 基因在脂肪组织维持机体物质与能量代 谢过程中起着重要的调控作用。研究表明，在脂肪 细胞增殖分化的不同阶段，MSTN 基因存在不同的 作用效应。MSTN 在脂肪细胞分化早期，主要作用 是诱导前体脂肪细胞增殖分化成为成熟脂肪细胞， 然而在成熟脂肪细胞形成后，MSTN 则主要抑制成 熟脂肪细胞向具有生物学作用的脂肪细胞进一步增 殖分化［49~51］ 。由此推测，MSTN 可调控脂肪细胞的 增殖分化以满足机体能量需要，其作用机制有待进 一步研究。通过 MSTN 基因敲除小鼠研究发现，除 表现明显 DMP 外，该小鼠脂肪沉积、血糖血脂水平 都显著低于 MSTN⁃wild 小鼠，并能抵抗由高脂饮食 诱导型肥胖，并且能通过 AMPK 信号通路降低胰岛 素抵抗。MSTN 基因可以直接作用于脂肪组织，参 与其代谢功能。研究 MSTN 过表达成年小鼠模型 发现，小鼠摄取的热量主要向肌肉转化而导致脂肪 沉积减少，该小鼠表现严重的整体衰竭综合征，肌肉 和脂肪体积都急剧减少，并且 MSTN 可以通过诱导 SMAD3 磷 酸 化 下 调 PPAR ⁃ γ 含 量 来 抑 制 脂 肪 形 成［52~54］。 由 此 推 测 ，MSTN 还 可 能 广 泛 参 与 代 谢 调控。 3 结 语 MSTN 可以直接或间接参与调控动物机体骨 骼肌增殖分化及生长发育，并且能结合多种细胞因 子广泛参与糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢、胰岛素 耐受、骨密度调控及雌性哺乳动物生殖调控等生命 过程，在肌肉萎缩、营养性肌发育不良、糖尿病、艾滋 病、心脏衰竭、肾脏衰竭和癌症等耗竭型疾病病理过 程中扮演着重要的角色。因此，MSTN 在医学领域 的地位不容忽视，但是到目前为止，大部分研究集中 于其调控经济动物生长性状改良方面，导致对其作 用机制方面的研究还比较欠缺，更没有形成系统信 号通路理论。目前随着以 CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRIS⁃ PR ⁃ associated proteins 9）、BE（base editing）为 代 表 的基因编辑技术的广泛应用，从而为对 MSTN 基因 进行分子水平操作开辟道路，通过基因编辑技术对 MSTN 基因进行定点敲除、干扰沉默、基因修饰等操 · 490 ·