《分析化学研究》：细胞电化学分析的研究进展（赵婧、朱小立、李根喜）

第40卷 分析化学( FENXI HUAXUE)研究 第期 2012年月 Chinese Journal of Analytical Chemistry DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.11202 细胞电化学分析的研究进展 赵婧1朱小立1李根喜l2 上海大学生命科学学院,上海2004442(南京大学生物化学系,医药生物技术国家重点实验室,南京210093) 摘要细胞是构成生命有机体的基本单位,对有机体的生长发育以及生理功能的维护起着至关重要的作 用。由于细胞中的各种生理活动多伴随着电荷的定向传递、传导或者转移,因此,结合电分析化学技术的简 单、便捷、灵敏以及快速的优势,细胞电分析化学逐渐发展成为了生物电分析化学的一个重要分支,为细胞活 性分析、疾病诊治以及药物筛选等研究提供了越来越多的理论支持,并奠定了重要的实验基础。近几年,随着 界面修饰技术、纳米技术、分子组装以及分子识别技术的发展,具有更高生物相容性和选择性的电极环境被开 发应用于细胞的固定,极大地促进了细胞电分析化学的发展。本文重点评述近三年细胞电化学分析的研究进 展,并以此为基础展望了其研究前景 关键词细胞;细胞凋亡;肿瘤细胞;电分析化学 1引言 细胞是构成有机体的基本单位,是有机体生长与发育的基础,是物质、能量和信息精巧结合的综合 体。对细胞的认识和理解是一切生命科学研究的基础。同时,一个细胞,无论处于兴奋状态,还是静息 状态,都会不断地产生电荷的变化,众多生理活动都伴随着电荷的定向传递、传导或者转移叫,因此,电 化学反应是细胞基本生命活动的重要基础 生物电化学是20世纪70年代兴起的一门采用电化学的基本原理和实验方法,在分子和细胞两个 不同水平上研究或模拟研究电荷在生物体系及其模拟体系中的分布、传输、转移及转化的交叉科学。 20世纪后期至今,生物电化学、尤其是生物电分析化学发展极为迅速-。其中,细胞的电化学分析作 为生物电分析化学的一个重要分支,引起了同行的广泛关注。以细胞作为直接的电化学研究对象更有 利于了解细胞内在的亚细胞反应机制,有助于深入探索其相关的生理活动;细胞内部级联放大反应可 以有效提高检测的灵敏度;从细胞内部提取的酶具有更高的生物活性,而使用从细胞中直接提取的物质 进行研究更可以降低检测分析的成本。因此,细胞的电分析化学研究正为深入认识有机体在细胞水平 上的运动规律以及揭示生命活动的奥妙提供越来越多有力的技术支持,为疾病诊治、药物设计、药物副 作用控制以及微生物监测等提供科学理论和实验依据。本文主要从细胞基本结构和功能、细胞凋亡 以及肿瘤细胞的电化学分析3个方面评述近3年细胞电化学分析的研究进展 2细胞基本结构和功能的电化学分析 20世纪90年代,研究者尝试通过蛋白膜伏安法技术将结构更为复杂的蛋白复合体—光系统I和 光系统Ⅱ固定在电极表面,并通过光系统的伏安行为对其电子传递过程进行体外模拟研究,以电化学 技术对光合作用的机理进行推测和验证。自此之后,生物电分析化学的探索就不再局限于简单的活 性小分子或者单个带有电活性中心的蛋白质,逐渐向更加宏观的细胞器,乃至整个活细胞拓展。 zhao等圓以牛血清白蛋白和戊二醛作为膜材料,将新鲜提取的线粒体固定在热解石墨电极表面(如图1 所示)。由于外加电场改变了线粒体外膜的通透性,位于线粒体内外膜之间的细胞色素c和FAD FADH2透过外膜的空隙与电极发生电子传递,产生了两对氧化还原峰,而线粒体内膜内侧的NADH则 在线粒体膜被破坏后与电极表面发生氧化还原反应产生信号响应。他们还发现,当琥珀酸加入到线粒 2011-10-24收稿:201}-1222接受 本文系国家自然科学基金资助项目(No90406005,61001035)和国家杰出青年科学基金资助项目(No,20925520)资助 E-mail:genxili@nju.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.11202 细胞电化学分析的研究进展 赵 婧1 朱小立1 李根喜* 1,2 1 (上海大学生命科学学院,上海 200444) 2(南京大学生物化学系,医药生物技术国家重点实验室,南京 210093) 摘 要 细胞是构成生命有机体的基本单位,对有机体的生长发育以及生理功能的维护起着至关重要的作 用。由于细胞中的各种生理活动多伴随着电荷的定向传递、传导或者转移,因此,结合电分析化学技术的简 单、便捷、灵敏以及快速的优势,细胞电分析化学逐渐发展成为了生物电分析化学的一个重要分支,为细胞活 性分析、疾病诊治以及药物筛选等研究提供了越来越多的理论支持,并奠定了重要的实验基础。近几年,随着 界面修饰技术、纳米技术、分子组装以及分子识别技术的发展,具有更高生物相容性和选择性的电极环境被开 发应用于细胞的固定,极大地促进了细胞电分析化学的发展。本文重点评述近三年细胞电化学分析的研究进 展,并以此为基础展望了其研究前景。 关键词 细胞;细胞凋亡;肿瘤细胞;电分析化学 2011-10-24 收稿;2011-12-22 接受 本文系国家自然科学基金资助项目(No.90406005,61001035)和国家杰出青年科学基金资助项目(No.20925520)资助 * E-mail: genxili@ nju.edu.cn 1 引 言 细胞是构成有机体的基本单位,是有机体生长与发育的基础,是物质、能量和信息精巧结合的综合 体。对细胞的认识和理解是一切生命科学研究的基础。同时,一个细胞,无论处于兴奋状态,还是静息 状态,都会不断地产生电荷的变化,众多生理活动都伴随着电荷的定向传递、传导或者转移[1],因此,电 化学反应是细胞基本生命活动的重要基础。 生物电化学是 20 世纪 70 年代兴起的一门采用电化学的基本原理和实验方法,在分子和细胞两个 不同水平上研究或模拟研究电荷在生物体系及其模拟体系中的分布、传输、转移及转化的交叉科学。 20 世纪后期至今,生物电化学、尤其是生物电分析化学发展极为迅速[2~6]。其中,细胞的电化学分析作 为生物电分析化学的一个重要分支,引起了同行的广泛关注。以细胞作为直接的电化学研究对象更有 利于了解细胞内在的亚细胞反应机制,有助于深入探索其相关的生理活动; 细胞内部级联放大反应可 以有效提高检测的灵敏度;从细胞内部提取的酶具有更高的生物活性,而使用从细胞中直接提取的物质 进行研究更可以降低检测分析的成本。因此,细胞的电分析化学研究正为深入认识有机体在细胞水平 上的运动规律以及揭示生命活动的奥妙提供越来越多有力的技术支持,为疾病诊治、药物设计、药物副 作用控制以及微生物监测等提供科学理论和实验依据[7]。本文主要从细胞基本结构和功能、细胞凋亡 以及肿瘤细胞的电化学分析 3 个方面评述近 3 年细胞电化学分析的研究进展。 2 细胞基本结构和功能的电化学分析 20 世纪 90 年代,研究者尝试通过蛋白膜伏安法技术将结构更为复杂的蛋白复合体———光系统 I 和 光系统 II 固定在电极表面,并通过光系统的伏安行为对其电子传递过程进行体外模拟研究,以电化学 技术对光合作用的机理进行推测和验证[8,9]。自此之后,生物电分析化学的探索就不再局限于简单的活 性小分子或 者 单 个 带 有 电 活 性 中 心 的 蛋 白 质,逐 渐 向 更 加 宏 观 的 细 胞 器,乃 至 整 个 活 细 胞 拓 展。 Zhao 等[10]以牛血清白蛋白和戊二醛作为膜材料,将新鲜提取的线粒体固定在热解石墨电极表面(如图 1 所示)。由于外加电场改 变 了 线 粒 体 外 膜 的 通 透 性,位 于 线 粒 体 内 外 膜 之 间 的 细 胞 色 素 c 和 FAD/ FADH2 透过外膜的空隙与电极发生电子传递,产生了两对氧化还原峰,而线粒体内膜内侧的 NADH 则 在线粒体膜被破坏后与电极表面发生氧化还原反应产生信号响应。他们还发现, 当琥珀酸加入到线粒 第 40 卷 2012 年月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~

分析化学 第40卷 体中后,促进了氧气接受电子生成活性氧物质(ROS),因而氧气的还原峰电化学信号随之增强。 Shkil 等叫直接将表面过量表达细胞色素氧化酶b2( Flavocytochrome b2,FCb2)的酵母细胞 Hansenula poly morpha固定在电极表面对L-乳酸呼吸进行体外模拟电化学研究。结果表明,由于细胞表面过量表达的 FC促进了L-乳酸呼吸代谢,因此氧气的还原电流随着乳酸的加入而逐渐下降 基于蛋白膜伏安法的研究基础,研究者制备了多种具有良好生物相容性的膜材料,并将细胞固定到 电极表面,进行电分析化学研究巴明。不同于传统的蛋白膜伏安法,Meng等叫提出了一种借助转染技术 将细胞固定在固体界面(金电极)的普适方法,并据此对细胞内物质进行了电化学分析探讨(如图1所 示)。依据外源DNA在Ca2+存在的条件下可以通过转染进入细胞体内的原理,在1moCa2存在的 条件下,293T细胞通过转染固定到巯基DNA修饰的金电极表面。此时,作为细胞固定工具的巯基DNA 又可作为电子传递的通道,促进细胞内的电活性物质和电极表面的电子传递。在该研究中,作为细胞染 色试剂的亚甲基蓝分子以及与细胞预培养的中药分子山奈酚均以巯基DNA为导线,随着细胞的固定与 电极发生电子传递产生相应的电化学信号。因此,该研究以核酸分子作为固定细胞的材料以及电子传 递通道,实现了细胞在电极界面的固定并得到胞内活性物质的电化学信号,使细胞内部物质的电化学分 析成为可能。基于上述细胞固定的方法,Liu等四提出了一种新颖的活细胞检测电化学手段。在Ca2+ 存在的条件下,人肝癌SMMC-7721细胞通过转染固定到电极表面,将DNA末端的二茂铁分子包含在细 胞内部,抑制了二茂铁与电极的电子传递,峰电流随着细胞浓度的增加而下降,可以在细胞浓度为 00~10°cel/mnL范围内线性检测细胞。 了-DNA 3细胞凋亡的电化学分析 细胞凋亡的失调与多种疾病密切相关,如 阿兹海默症、各种肿瘤、艾滋病以及自身免疫 病等叫n,因此细胞调亡的检测不仅有助于5:5 @0 提高病程判断的准确性,更可以作为治疗干预 效果判断的早期标志 图1金电极表面组装293T细胞及胞内活性物质通过电极表 在早期凋亡的细胞中,磷脂酰丝氨酸会从面固定的DNA与电极进行电子传递的示意图叫 细胞质膜的内侧翻转到外侧,从而暴露在细胞 Fig. I Illustration of the assembly of293 T cells on a gold elec-- 外表面。因此,以Ca2依赖性磷脂结合蛋 trode surface and the electric communication between the electro- 白——膜联蛋白( Annexin v)作为探针特异 active species inside the cells and the electrode via the transfected 性地识别细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸是细 surface-immobilized DNA 胞凋亡检测最常用的手段之一吗明。Tong等通过电极表面的金纳米颗粒层将膜联蛋白Ⅴ固定在电极 表面。随后,表面暴露有大量磷脂酰丝氨酸的早期凋亡细胞通过和膜联蛋白V紧密结合固定在电极表 面,阻碍了溶液中铁氰化钾分子与电极的电子传递,增加了电极表面的阻抗值。Liu等凹以聚乙醇胺作 为膜材料将膜联蛋白Ⅴ固定在电极表面用以识别和结合早期凋亡细胞。研究表明,凋亡的A549细胞 固定在电极表面以后,大大降低了电化学探针二氯化五氨合氯钌与电极之间的电子传递速率,导致了二 氯化五氨合氯钌峰电流值下降。同时,膜联蛋白V的功能促进剂Ca2可以有效地提高细胞凋亡电化 分析的效率 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶( Cysteine-dependent aspartate-specific proteinases, Caspases)是在活 细胞和细胞裂解液中检测凋亡的重要标记物。其中, Caspase-3作为最重要的细胞凋亡执行者,可以特 异性切割含有 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)序列的底物多肽四。Xiao等基于细胞裂解液中 Caspase-3酶 活性检测提出了一种细胞凋亡检测的电化学方案。电极表面底物多肽末端的二茂铁分子发生氧化还 原反应可以产生电化学信号。当凋亡细胞裂解液中含有的大量 Caspase3特异性识别并切割多肽底物 后,二茂铁分子远离电极,失去电化学响应。 Zhang等以碳纳米管为信号放大的载体,通过层层组装 技术在其表面共修饰链霉亲和素和量子点作为电化学信号探针(如图2所示)。当探针通过与底物多肽 末端的生物素结合固定到电极表面后,利用阳极溶出伏安法可以检测到碳纳米管探针中镉的溶出信号

体中后,促进了氧气接受电子生成活性氧物质(ROS),因而氧气的还原峰电化学信号随之增强。Shkil 等[11]直接将表面过量表达细胞色素氧化酶 b2 (Flavocytochrome b2,FC b2)的酵母细胞 Hansenula poly￾morpha 固定在电极表面对 L-乳酸呼吸进行体外模拟电化学研究。结果表明,由于细胞表面过量表达的 FC 促进了 L-乳酸呼吸代谢,因此氧气的还原电流随着乳酸的加入而逐渐下降。 基于蛋白膜伏安法的研究基础,研究者制备了多种具有良好生物相容性的膜材料,并将细胞固定到 电极表面,进行电分析化学研究[12,13]。不同于传统的蛋白膜伏安法,Meng 等[14]提出了一种借助转染技术 将细胞固定在固体界面(金电极)的普适方法,并据此对细胞内物质进行了电化学分析探讨(如图 1 所 示)。依据外源 DNA 在 Ca 2+ 存在的条件下可以通过转染进入细胞体内的原理,在 1 mol/L Ca 2+ 存在的 条件下,293T 细胞通过转染固定到巯基 DNA 修饰的金电极表面。此时,作为细胞固定工具的巯基 DNA 又可作为电子传递的通道,促进细胞内的电活性物质和电极表面的电子传递。在该研究中,作为细胞染 色试剂的亚甲基蓝分子以及与细胞预培养的中药分子山奈酚均以巯基 DNA 为导线,随着细胞的固定与 电极发生电子传递产生相应的电化学信号。因此,该研究以核酸分子作为固定细胞的材料以及电子传 递通道,实现了细胞在电极界面的固定并得到胞内活性物质的电化学信号,使细胞内部物质的电化学分 析成为可能。基于上述细胞固定的方法,Liu 等[15]提出了一种新颖的活细胞检测电化学手段。在 Ca 2+ 存在的条件下,人肝癌 SMMC-7721 细胞通过转染固定到电极表面,将 DNA 末端的二茂铁分子包含在细 胞内部,抑制了二茂铁与电极的电子传递,峰电流随着细胞浓度的增加而下降,可以在细胞浓度为 图 1 金电极表面组装 293T 细胞及胞内活性物质通过电极表 面固定的 DNA 与电极进行电子传递的示意图[14] Fig.1 Illustration of the assembly of 293T cells on a gold elec￾trode surface and the electric communication between the electro￾active species inside the cells and the electrode via the transfected surface-immobilized DNA [14] 500~10 6 cell/mL 范围内线性检测细胞。 3 细胞凋亡的电化学分析 细胞凋亡的失调与多种疾病密切相关,如 阿兹海默症、各种肿瘤、艾滋病以及自身免疫 病等[16,17]。因此,细胞凋亡的检测不仅有助于 提高病程判断的准确性,更可以作为治疗干预 效果判断的早期标志。 在早期凋亡的细胞中,磷脂酰丝氨酸会从 细胞质膜的内侧翻转到外侧,从而暴露在细胞 外表 面。 因 此,以 Ca 2+ 依 赖 性 磷 脂 结 合 蛋 白———膜联蛋白 V(Annexin V)作为探针特异 性地识别细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸是细 胞凋亡检测最常用的手段之一[18,19]。Tong 等[20]通过电极表面的金纳米颗粒层将膜联蛋白 V 固定在电极 表面。随后,表面暴露有大量磷脂酰丝氨酸的早期凋亡细胞通过和膜联蛋白 V 紧密结合固定在电极表 面,阻碍了溶液中铁氰化钾分子与电极的电子传递,增加了电极表面的阻抗值。Liu 等[21]以聚乙醇胺作 为膜材料将膜联蛋白 V 固定在电极表面用以识别和结合早期凋亡细胞。研究表明,凋亡的 A549 细胞 固定在电极表面以后,大大降低了电化学探针二氯化五氨合氯钌与电极之间的电子传递速率,导致了二 氯化五氨合氯钌峰电流值下降。同时,膜联蛋白 V 的功能促进剂 Ca 2+ 可以有效地提高细胞凋亡电化学 分析的效率。 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteine-dependent aspartate-specific proteinases,Caspases)是在活 细胞和细胞裂解液中检测凋亡的重要标记物。其中,Caspase-3 作为最重要的细胞凋亡执行者,可以特 异性切割含有 Asp-Glu-Va-l Asp (DEVD)序列的底物多肽[22]。Xiao 等[23]基于细胞裂解液中 Caspase-3 酶 活性检测,提出了一种细胞凋亡检测的电化学方案。电极表面底物多肽末端的二茂铁分子发生氧化还 原反应可以产生电化学信号。当凋亡细胞裂解液中含有的大量 Caspase-3 特异性识别并切割多肽底物 后,二茂铁分子远离电极,失去电化学响应。Zhang 等[24]以碳纳米管为信号放大的载体,通过层层组装 技术在其表面共修饰链霉亲和素和量子点作为电化学信号探针(如图 2 所示)。当探针通过与底物多肽 末端的生物素结合固定到电极表面后,利用阳极溶出伏安法可以检测到碳纳米管探针中镉的溶出信号。 分 析 化 学 第 40 卷

第期 赵婧等:细胞电化学分析的研究进展 然而,当体系中加入凋亡细胞的裂解液, Caspase3识别并切割底物多肽使生物素离开电极表面从而失 格症的早期诊断是提高将症治疗成功率和病“2 去电化学响应。进一步研究发现,峰电流随 caspase3抑制剂AcDEⅤDCHO浓度增加而升高,随着抗 肿瘤药物依托泊甙( Etoposide)浓度的增加而降低。 肿瘤细胞的电化学分析 →I 癌症是当今世界上引起死亡率最高的疾病之 存活率最重要和最有效的保障之一。因此,肿瘤细 胞的检测备受关注 4.1肿瘤细胞表面多糖的电化学分析 轴 PDCNT CdTe ODs 细胞表面的糖类在癌症的发生和迁移过程中起 着重要作用,常作为肿瘤细胞检测的靶位点阿。因 此,对细胞表面糖类的电化学分析不仅有助于了解图2制备电化学信号探针以及电化学检测ca9pae3 它们在疾病发展中的作用,更有助于肿瘤的早期诊活性的示意图P 断。如图3所示,Ding等利用电极表面的甘露糖基rg2 Schematic illustration of the process for preparing 分子和肿瘤细胞表面的多糖竞争结合植物凝集素伴 lectrochemical signal probes and the electrochemical 刀豆球蛋白A(ConA),提出了一种肿瘤细胞表面多 strategy for sensing caspase-3 activity門( Reprinted with 糖分析的电化学方法。研究表明,由于表面富含 permission from The Royal Society of Chemistry 甘露糖的白血病细胞K562与电极表面的甘露糖竞 争结合溶液中量子点标记的ConA,结合到电极表面的ConA就会相对减少,因而降低了电化学信号响 应。此方法可以检测到细胞浓度低至102 cell/mL的肿瘤细胞,是高度灵敏的检测手段。Sha等凹将电 活性物质5-羟基-3-已二硫醇-1,4萘醌(JUG)和抗选择素适体共修饰在金电极表面。通过表面富含多 糖的人结肠腺癌细胞LS180与适体竞争结合选择素引起峰电流变化,此方法可以在细胞浓度为103 l0 cell/mL范围内线性检测肿瘤细胞。 Zhang等以氮掺杂的碳纳米管、硫堇和金纳米颗粒混合修饰在 电极表面吸附ConA作为第一重信号放大,以辣根过氧化物酶标记的p-糖蛋白抗体催化过氧化氢作为 第二重信号放大,实现了细胞浓度在80×102~20×10cel/mnL范围内线性检测Hela细胞,并测得一个 Hela细胞相当于(4±2)×100个甘露糖基和957×102pgp-糖蛋白。通过电极表面和金纳米颗粒表面 的ConA与白血病细胞K562形成三明治结构,将细胞固定在电极表面,以金纳米颗粒表面的大量二茂 铁分子作为电化学信号分子。Ding等实现了细胞浓度在10×102~1.0×107 cell/mL范围内线性检测 肿瘤细胞,并测得一个K562细胞相当于47×10个自由的甘露糖基分子。 Cheng等即通过肿瘤细胞表 面过量表达的整合素受体与单壁碳纳米管表面修饰的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)短肽特 异性识别将人胃癌细胞BGC-83固定在电极表面,通过辣根过氧化物酶修饰的ConA进一步与细胞表 面的甘露糖基特异性结合,并催化过氧化氢产生电化学信号,检测到细胞低至浓度620cel/mL的肿瘤细 胞四。 Zhang等甽报道了一种基于凝集素的生物传感器用于电化学分析细胞表面与肿瘤相关的糖基化 状况。研究发现,甘露糖基在肿瘤细胞和正常细胞表面均有较高的表达量,而唾液酸则在肿瘤细胞表面 表达更为丰富。 4.2基于核酸适体的肿瘤细胞电化学分析 核酸适体是经体外筛选技术 SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其它 小分子的寡聚核苷酸片段,基于适体研制的生物传感器已被广泛运用于生物分析中四明。近年来,随着 肿瘤标记物的核酸适体,越来越多的适体传感器被用于检测肿瘤标记物,甚至是肿瘤细胞的研究- 基于适体修饰的金电极,Pan等提出了一种无需标记的电化学生物传感器,用于白血病细胞的选择性 检测。基于白血病细胞 CCRF-CEM结合适体分子(sgc8c)固定在电极表面后引起的阻抗值变化,此方法 的检测细胞线性范围为10×104~1.0×107 cell/mL,检出限为6000 cell/mL。Ding将 Ramos细胞适体与 硫化镉纳米颗粒修饰的链接DNA共冋修饰在金纳米颗粒表面制备岀金纳米探针,同时,磁珠表面的捕

然而,当体系中加入凋亡细胞的裂解液,Caspase-3 识别并切割底物多肽使生物素离开电极表面从而失 去电化学响应。进一步研究发现,峰电流随 caspase-3 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 浓度增加而升高,随着抗 图 2 制备电化学信号探针以及电化学检测 caspase-3 活性的示意图[24] Fig.2 Schematic illustration of the process for preparing electrochemical signal probes and the electrochemical strategy for sensing caspase-3 activity [24] (Reprinted with permission from The Royal Society of Chemistry) 肿瘤药物依托泊甙(Etoposide)浓度的增加而降低。 4 肿瘤细胞的电化学分析 癌症是 当 今 世 界 上 引 起 死 亡 率 最 高 的 疾 病 之 一。癌症的早期诊断是提高癌症治疗成功率和病人 存活率最重要和最有效的保障之一。因此,肿瘤细 胞的检测备受关注[25~28]。 4.1 肿瘤细胞表面多糖的电化学分析 细胞表面的糖类在癌症的发生和迁移过程中起 着重要作用,常作为肿瘤细胞检测的靶位点[29]。因 此,对细胞表面糖类的电化学分析不仅有助于了解 它们在疾病发展中的作用,更有助于肿瘤的早期诊 断。如图 3 所示,Ding 等利用电极表面的甘露糖基 分子和肿瘤细胞表面的多糖竞争结合植物凝集素伴 刀豆球蛋白 A(Con A),提出了一种肿瘤细胞表面多 糖分析的电化学方法[30]。研究表明,由于表面富含 甘露糖的白血病细胞 K562 与电极表面的甘露糖竞 争结合溶液中量子点标记的 Con A,结合到电极表面的 Con A 就会相对减少,因而降低了电化学信号响 应。此方法可以检测到细胞浓度低至 10 2 cell/mL 的肿瘤细胞,是高度灵敏的检测手段。Shao 等[31]将电 活性物质 5-羟基-3-己二硫醇-1,4-萘醌(JUGthio)和抗选择素适体共修饰在金电极表面。通过表面富含多 糖的人结肠腺癌细胞 LS180 与适体竞争结合选择素引起峰电流变化,此方法可以在细胞浓度为 10 3 ~ 10 7 cell/mL 范围内线性检测肿瘤细胞。Zhang 等[32]以氮掺杂的碳纳米管、硫堇和金纳米颗粒混合修饰在 电极表面吸附 Con A 作为第一重信号放大,以辣根过氧化物酶标记的p-糖蛋白抗体催化过氧化氢作为 第二重信号放大,实现了细胞浓度在 8.0×10 2~2.0×10 7 cell/mL 范围内线性检测 Hela 细胞,并测得一个 Hela 细胞相当于(4±2)×10 10个甘露糖基和 9.57×10 -2 pgp-糖蛋白。通过电极表面和金纳米颗粒表面 的 Con A 与白血病细胞 K562 形成三明治结构,将细胞固定在电极表面,以金纳米颗粒表面的大量二茂 铁分子作为电化学信号分子。Ding 等[33]实现了细胞浓度在 1.0×10 2~1.0×10 7 cell/mL 范围内线性检测 肿瘤细胞,并测得一个 K562 细胞相当于 4.7×10 9 个自由的甘露糖基分子。Cheng 等[34]通过肿瘤细胞表 面过量表达的整合素受体与单壁碳纳米管表面修饰的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)短肽特 异性识别将人胃癌细胞 BGC-823 固定在电极表面,通过辣根过氧化物酶修饰的 Con A 进一步与细胞表 面的甘露糖基特异性结合,并催化过氧化氢产生电化学信号,检测到细胞低至浓度 620cell/mL 的肿瘤细 胞[35]。Zhang 等[36]报道了一种基于凝集素的生物传感器用于电化学分析细胞表面与肿瘤相关的糖基化 状况。研究发现,甘露糖基在肿瘤细胞和正常细胞表面均有较高的表达量,而唾液酸则在肿瘤细胞表面 表达更为丰富。 4.2 基于核酸适体的肿瘤细胞电化学分析 核酸适体是经体外筛选技术 SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其它 小分子的寡聚核苷酸片段,基于适体研制的生物传感器已被广泛运用于生物分析中[37~40]。近年来,随着 肿瘤标记物的核酸适体,越来越多的适体传感器被用于检测肿瘤标记物,甚至是肿瘤细胞的研究[41~44]。 基于适体修饰的金电极,Pan 等[45]提出了一种无需标记的电化学生物传感器,用于白血病细胞的选择性 检测。基于白血病细胞 CCRF-CEM 结合适体分子(sgc8c)固定在电极表面后引起的阻抗值变化,此方法 的检测细胞线性范围为 1.0×10 4~1.0×10 7 cell/mL,检出限为 6000 cell/mL。Ding 将[46]Ramos 细胞适体与 硫化镉纳米颗粒修饰的链接 DNA 共同修饰在金纳米颗粒表面制备出金纳米探针,同时,磁珠表面的捕 第期 赵 婧等: 细胞电化学分析的研究进展

分析化学 第40卷 获DNA和金纳米探针上的适体部分杂交形成磁珠 金纳米颗粒-硫化镉复合物。当人淋巴瘤细胞 Ramos 存在时,适体链与捕获DNA分离而结合到细胞表 多 面,引起金纳米探针在细胞表面的聚集。通过电化 学技术检测细胞表面的硫化镉纳米颗粒的溶出信 号,可以检测到1.0×102~1.0×105 cell/mL范围的肿 瘤细胞,检出限为67cel!mnL。Li等通过电极表面修 lycan→、QD 饰的MUCI适配体和硫化镉纳米颗粒标记的癌胚抗 HNOa 原(CEA)抗体同时识别乳腺癌细胞MCF-7表面的 MUC1蛋白和CEA蛋白,将细胞固定在电极表面并图3电化学分析细胞表面多糖的示意图网 得到电化学响应(如图4所示),检测线性范围为Fig3 Schematic representation of the electrochemical l0~10cl/mnL。该方法通过同时检测两种肿瘤标 assay of cell surface carbohydrate( Reprint 记物(MuC1和CEA)对细胞进行定量检测,有效避 permission from American Chemical Society) 免了肿瘤细胞检测中的假阳性结果 plamer MUCI MCF-7 Cds NPOs 图4通过同时识别两种不同的肿瘤标记物检测乳腺癌细胞的示意图H7 ig. 4 Schematic illustration of the method to detect breast cancer cells through simultaneous recognition of two fferent tumor markers HT 4.3基于端粒酶活性分析的肿瘤细胞电化学分析 端粒及端粒酶与肿瘤发生和异常增殖密切相关,因而有望成为在肿瘤的诊断和治疗上行之有效的 新靶目标悶。Chen等基于PCR技术提出了通过电化学检测细胞裂解液中的端粒酶活性来辨别肿瘤 细胞的方法。与细胞裂解液共培养的端粒酶反应引物核酸序列经过PCR扩增后,利用差分脉冲伏安法 可以检测其中鸟嘌呤电化学响应。由于肿瘤细胞裂解液中含有大量的端粒酶使核酸引物发生延伸反 应,多个富含G的端粒扩增序列被加至引物上,经过PCR扩増后,可以检测到极为明显的鸟嘌呤氧化信 号,而正常细胞中的端粒酶活性较弱,即使经过PCR扩增,得到的电化学响应也很微弱。Shao等國报道 了一种无需PCR检测肿瘤细胞内端粒酶活性的电化学方法。由于Hela细胞裂解液中的端粒酶促发电 极表面核酸引物的延伸,电极表面的鸟嘌呤氧化信号随之增加。该方法可以检测到3000个Hela细胞 含有的端粒酶的活性,是极为灵敏的检测手段。基于以上类似的原理,Yang等提出了一种检测肿瘤 细胞中端粒酶活性的电化学阻抗传感器。而Li等基于金纳米颗粒信号放大作用提出了一种超灵敏 的端粒酶活性检测方法,可以检测到仅10个肿瘤细胞中含有的端粒酶活性, 4.4基于纳米材料的肿瘤细胞电化学分析 由于纳米材料在光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的独特优势,越来越多的纳米材料功能 化电极也被运用到细胞的固定以及电化学分析中。Ja等明利用正电性的磁性纳米颗粒提出了一种快 速磁分离、固定和电化学检测细胞的方法。当白血病K562细胞和磁性纳米颗粒(3-氨丙基三乙氧基硅 烷处理的四氧化三铁颗粒)共培养 间后,磁性纳米颗粒修饰的细胞在磁场的作用下从培养基中被 分离出来,紧密结合到电极表面。细胞内生的电活性物质在电极表面产生一个明显的阳极峰,但是,随

图 3 电化学分析细胞表面多糖的示意图[30] Fig. 3 Schematic representation of the electrochemical assay of cell surface carbohydrate [30] (Reprinted with permission from American Chemical Society) 获 DNA 和金纳米探针上的适体部分杂交形成磁珠- 金纳米颗粒-硫化镉复合物。当人淋巴瘤细胞 Ramos 存在时,适 体 链 与 捕 获 DNA 分 离 而 结 合 到 细 胞 表 面,引起金纳米探针在细胞表面的聚集。通过电化 学技术检测细胞表面的硫化镉纳 米 颗 粒 的 溶 出 信 号,可以检测到 1.0×10 2~1.0×10 5 cell/mL 范围的肿 瘤细胞,检出限为 67 cell/mL。Li 等通过电极表面修 饰的 MUC1 适配体和硫化镉纳米颗粒标记的癌胚抗 原(CEA)抗体同时识别乳腺癌细胞 MCF-7 表面的 MUC1 蛋白和 CEA 蛋白,将细胞固定在电极表面并 得到电化学响应(如图 4 所示)[47],检测线性范围为 10 4~10 7 cell/mL。该方法通过同时检测两种肿瘤标 记物(MUC1 和 CEA)对细胞进行定量检测,有效避 免了肿瘤细胞检测中的假阳性结果。 图 4 通过同时识别两种不同的肿瘤标记物检测乳腺癌细胞的示意图[47] Fig.4 Schematic illustration of the method to detect breast cancer cells through simultaneous recognition of two different tumor markers [47] 4.3 基于端粒酶活性分析的肿瘤细胞电化学分析 端粒及端粒酶与肿瘤发生和异常增殖密切相关,因而有望成为在肿瘤的诊断和治疗上行之有效的 新靶目标[48]。Chen 等[49]基于 PCR 技术提出了通过电化学检测细胞裂解液中的端粒酶活性来辨别肿瘤 细胞的方法。与细胞裂解液共培养的端粒酶反应引物核酸序列经过 PCR 扩增后,利用差分脉冲伏安法 可以检测其中鸟嘌呤电化学响应。由于肿瘤细胞裂解液中含有大量的端粒酶使核酸引物发生延伸反 应,多个富含 G 的端粒扩增序列被加至引物上,经过 PCR 扩增后,可以检测到极为明显的鸟嘌呤氧化信 号,而正常细胞中的端粒酶活性较弱,即使经过 PCR 扩增,得到的电化学响应也很微弱。Shao 等[50]报道 了一种无需 PCR 检测肿瘤细胞内端粒酶活性的电化学方法。由于 Hela 细胞裂解液中的端粒酶促发电 极表面核酸引物的延伸,电极表面的鸟嘌呤氧化信号随之增加。该方法可以检测到 3000 个 Hela 细胞 含有的端粒酶的活性,是极为灵敏的检测手段。基于以上类似的原理,Yang 等[51]提出了一种检测肿瘤 细胞中端粒酶活性的电化学阻抗传感器。而 Li 等[52]基于金纳米颗粒信号放大作用提出了一种超灵敏 的端粒酶活性检测方法,可以检测到仅 10 个肿瘤细胞中含有的端粒酶活性。 4.4 基于纳米材料的肿瘤细胞电化学分析 由于纳米材料在光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的独特优势,越来越多的纳米材料功能 化电极也被运用到细胞的固定以及电化学分析中。Jia 等[53]利用正电性的磁性纳米颗粒提出了一种快 速磁分离、固定和电化学检测细胞的方法。当白血病 K562 细胞和磁性纳米颗粒(3-氨丙基三乙氧基硅 烷处理的四氧化三铁颗粒)共培养一段时间后,磁性纳米颗粒修饰的细胞在磁场的作用下从培养基中被 分离出来,紧密结合到电极表面。细胞内生的电活性物质在电极表面产生一个明显的阳极峰,但是,随 分 析 化 学 第 40 卷

第期 赵婧等:细胞电化学分析的研究进展 着抗肿瘤药物5氟尿嘧啶的加入,肿瘤细胞的生长被抑制,此峰电流下降。 Zhong等馴采用3氨基苯硼 酸功能化的多壁碳纳米管修饰电极非常有效地检测了细胞。实验表明,碳纳米管提供了更为丰富的位 点结合氨基苯硼酸,以助于提高检测的灵敏性;同时,其高效的电子传导性使电化学检测更为方便 Gu等閃将金纳米颗粒组装在聚苯乙烯和聚乙烯合成的核壳结构纳米复合物表面用以电极界面的修饰。 当急性粒细胞白血病细胞HL60结合到电极表面后,电极表面的阻抗值和细胞浓度的对数值在1.6× 103~1.6×10cl/mL浓度范围内呈线性关系,检出限为7.3×102ce/mnL。利用功能化石墨烯和适配体 ASl14ll,reng等圖发展了一种可以重复使用的电化学传感器进行无需标记的肿瘤细胞检测。研究表 明,功能化的石墨烯表面具有良好的生物相容性,很好地维护了肿瘤细胞的生物活性。Lu等國将叶酸 功能化的金纳米颗粒修饰在金电极表面,构建了一种检测叶酸受体阳性肿瘤细胞的电化学方法。当表 面过量表达叶酸受体的肿瘤细胞(如卵巢癌细胞和人宫颈癌细胞)与金纳米颗粒表面的叶酸分子结合 后,会阻碍铁氰化钾和电极的电子传递,导致铁氰化钾的峰电流下降。 4.5肿瘤细胞在电极表面的直接固定及电化学分析 dela Escosura- Muniz等直接将B淋巴瘤细胞HMy2( HLA-DR阳性)和人前列腺癌PC-3( HLA-DR 阴性)细胞固定生长在碳涂层电极表面,发现碳涂层电极表面生长的细胞状况良好,类似于其在塑料培 养瓶中的状态。通过aDR抗体和细胞表面表达的HLA-DR分子之间的免疫反应,依据金纳米颗粒的催 化信号, HLA-DR阳性的HMy2细胞可以轻易与阴性对照细胞PC-3区分开来。E-Said等例将Hela细 胞直接固定在金膜覆盖的硅基底上并基于此对抗肿瘤药物(羟基脲和环磷酰胺)的生物毒性进行分析。 研究表明,固定在金表面的Hela细胞可以展现出一个良好的准可逆循环伏安响应,且峰电流随着细胞 浓度的增加呈线性增长,但此电化学响应会随着肿瘤药物浓度增加而降低。 4.6肿瘤细胞代谢的电化学分析 以前列腺癌细胞PC-3为模型,wu等研究表明,多壁碳纳米管修饰的玻碳电极在含有PC-3细胞 悬浮液中得到的伏安响应是来源于细胞分解代谢鸟嘌呤核苷酸和黄嘌呤核苷酸的产物黄嘌呤和鸟嘌呤 碱基。细胞分泌的时间越长,鸟嘌呤和黄嘌呤的峰电流值越高。同时,通过热失活的方法可以促进细胞 内的黄嘌呤和鸟嘌呤释放至细胞外环境中从而提高鸟嘌呤和黄嘌呤的检岀信号。 Bareket等利用甲 醛脱氢酶和碳纳米管修饰的碳涂层电极构建了灵敏的甲醛电化学传感器,用于丁酸类药物在人恶性胶质 瘤U251内代谢的检测,结果表明,细胞内药物代谢的产物甲醛可以通过扩散作用释放至细胞外环境 5结论与展望 近年来,随着界面修饰技术、纳米技术以及分子识别技术的发展和完善,生物电分析化学的研究也 不再局限于单纯的蛋白质或者活性小分子的研究,更注重于宏观的细胞器,甚至细胞的研究。在今后一 段时间内,细胞的电分析化学研究将有可能集中在以下几个方面开展:(1)发展有效的电化学分析技术 手段,实时监控细胞体内的电子传递过程,揭示生命活动的奥秘;(2)完善电极界面的修饰技术,提高电 极界面的生物相容性,实现更多种类细胞在电极界面的固定并稳定维护细胞活性,便于细胞动态电化学 的体外研究以及药物筛选和药物细胞毒性分析;(3)依托分子识别技术的发展,提高细胞检测的灵敏度 和准确度,实现临床样本中肿瘤细胞早期快速灵敏的检测以及各种疾病的有效诊断;(4)基于纳米材料 在界面修饰以及信号放大的优势,构建高稳定、小型化、便携化、经济化的商品化细胞传感器满足临床实 时监测的需求。总之,细胞的电分析化学研究必将成为生命分析科学的一个更加热门的研究领域,为生 物电分析化学的发展做出贡献,并且为保障人类生命健康提供有力的实验基础和技术支持 References 1 GAO Ti-Yu, FENG Jun, CI Yun-Xiang. Prog. Chem., 1998, 10(3): 305-311 高体玉,冯军,慈云祥,化学进展,1998,10(3):305~311 2 Wang j.Chem.Rev,,2008,108(2):814~825 3 Zhao J, Meng WY, Miao P, Yu G, Li Gx. Int. J. Mol. Sci., 2008, 9(2):145-153

着抗肿瘤药物 5-氟尿嘧啶的加入,肿瘤细胞的生长被抑制,此峰电流下降。Zhong 等[54]采用 3-氨基苯硼 酸功能化的多壁碳纳米管修饰电极非常有效地检测了细胞。实验表明,碳纳米管提供了更为丰富的位 点结合氨基苯硼酸,以助于提高检测的灵敏性;同时,其高效的电子传导性使电化学检测更为方便。 Gu 等[55]将金纳米颗粒组装在聚苯乙烯和聚乙烯合成的核壳结构纳米复合物表面用以电极界面的修饰。 当急性粒细胞白血病细胞 HL-60 结合到电极表面后,电极表面的阻抗值和细胞浓度的对数值在 1.6× 10 3~1.6×10 8 cell/mL 浓度范围内呈线性关系,检出限为 7.3×10 2 cell/mL。利用功能化石墨烯和适配体 AS1411,Feng 等[56]发展了一种可以重复使用的电化学传感器进行无需标记的肿瘤细胞检测。研究表 明,功能化的石墨烯表面具有良好的生物相容性,很好地维护了肿瘤细胞的生物活性。Liu 等[57]将叶酸 功能化的金纳米颗粒修饰在金电极表面,构建了一种检测叶酸受体阳性肿瘤细胞的电化学方法。当表 面过量表达叶酸受体的肿瘤细胞(如卵巢癌细胞和人宫颈癌细胞)与金纳米颗粒表面的叶酸分子结合 后,会阻碍铁氰化钾和电极的电子传递,导致铁氰化钾的峰电流下降。 4.5 肿瘤细胞在电极表面的直接固定及电化学分析 dela Escosura-Muñiz 等[58]直接将 B 淋巴瘤细胞 HMy2 (HLA-DR 阳性)和人前列腺癌 PC-3(HLA-DR 阴性)细胞固定生长在碳涂层电极表面,发现碳涂层电极表面生长的细胞状况良好,类似于其在塑料培 养瓶中的状态。通过αDR 抗体和细胞表面表达的 HLA-DR 分子之间的免疫反应,依据金纳米颗粒的催 化信号,HLA-DR 阳性的 HMy2 细胞可以轻易与阴性对照细胞 PC-3 区分开来。E-l Said 等[59] 将 Hela 细 胞直接固定在金膜覆盖的硅基底上并基于此对抗肿瘤药物(羟基脲和环磷酰胺)的生物毒性进行分析。 研究表明,固定在金表面的 Hela 细胞可以展现出一个良好的准可逆循环伏安响应,且峰电流随着细胞 浓度的增加呈线性增长,但此电化学响应会随着肿瘤药物浓度增加而降低。 4.6 肿瘤细胞代谢的电化学分析 以前列腺癌细胞 PC-3 为模型,Wu 等[60]研究表明,多壁碳纳米管修饰的玻碳电极在含有 PC-3 细胞 悬浮液中得到的伏安响应是来源于细胞分解代谢鸟嘌呤核苷酸和黄嘌呤核苷酸的产物黄嘌呤和鸟嘌呤 碱基。细胞分泌的时间越长,鸟嘌呤和黄嘌呤的峰电流值越高。同时,通过热失活的方法可以促进细胞 内的黄嘌呤和鸟嘌呤释放至细胞外环境中从而提高鸟嘌呤和黄嘌呤的检出信号[61]。Bareket 等[62]利用甲 醛脱氢酶和碳纳米管修饰的碳涂层电极构建了灵敏的甲醛电化学传感器,用于丁酸类药物在人恶性胶质 瘤 U251 内代谢的检测,结果表明,细胞内药物代谢的产物甲醛可以通过扩散作用释放至细胞外环境。 5 结论与展望 近年来,随着界面修饰技术、纳米技术以及分子识别技术的发展和完善,生物电分析化学的研究也 不再局限于单纯的蛋白质或者活性小分子的研究,更注重于宏观的细胞器,甚至细胞的研究。在今后一 段时间内,细胞的电分析化学研究将有可能集中在以下几个方面开展:(1)发展有效的电化学分析技术 手段,实时监控细胞体内的电子传递过程,揭示生命活动的奥秘;(2)完善电极界面的修饰技术,提高电 极界面的生物相容性,实现更多种类细胞在电极界面的固定并稳定维护细胞活性,便于细胞动态电化学 的体外研究以及药物筛选和药物细胞毒性分析;(3)依托分子识别技术的发展,提高细胞检测的灵敏度 和准确度,实现临床样本中肿瘤细胞早期快速灵敏的检测以及各种疾病的有效诊断;(4)基于纳米材料 在界面修饰以及信号放大的优势,构建高稳定、小型化、便携化、经济化的商品化细胞传感器满足临床实 时监测的需求。总之,细胞的电分析化学研究必将成为生命分析科学的一个更加热门的研究领域,为生 物电分析化学的发展做出贡献,并且为保障人类生命健康提供有力的实验基础和技术支持。 References 1 GAOTi-Yu,FENGJun,CIYun-Xiang.Prog.Chem.,1998,10(3):305~311 高体玉,冯 军,慈云祥.化学进展,1998,10(3):305~311 2 WangJ.Chem.Rev.,2008,108(2):814~825 3 ZhaoJ,MengW Y,MiaoP,YuZG,LiGX.Int.J.Mol.Sci.,2008,9(2):145~153 第期 赵 婧等: 细胞电化学分析的研究进展