·20 弟二章微生物的纯培养和显微技术 一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氯保藏可达到 -196℃。因此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各 种微生物保方法中是较理想的一种。但液氯保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机 构采用。与此相应，冰箱保藏使用更为普遍。在各种基因工程手册中，一般都推荐在-0℃低温冰 箱中保存菌株或细胞的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感受态的细胞 在没有低温冰箱的条件下，也可利用-20~-30℃的普通冰箱怜冻室保存菌种。但应注意加有保 护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内，常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培 养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往 往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。 3.干燥保法 水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技 术中另一项经常采用的手段】 沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢 子的微生物，如芽孢杆菌、放线菊等 ,一般将莲种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢了 制备孢子悬液，加人无菌的沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口、 置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保蔬较长时间，话合一般实验室及以故线第等为菌科 的发酵工厂采用。 冷冻真空干燥保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升 华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物 处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除 去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭 的菌种安瓿管的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保薰是目前使用最普遍，也是最重 要的微生物保慧方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要的激生物保存手段。 除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由 于徽生物的多样性，不同的徽生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有-一种方 法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性，保藏 物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采 用各种不同的手段进行保戴，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 第二节显微镜和显微技术 绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助显微镜放大系统的作 用才能看到它们的个体形茶和内部构造。除了放大外，决定显微现客效果的还有一个重要的因素 即分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程 度，它们与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本 制作和观察技术，这就是显微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展 到对物体的组成成分定性和定量，特别是与计算科学技术的结合出现的图像分析、模拟仿真等技
第二节显微镜和显微技术 ·21· 术，为探索微生物的奥秘增添了强大武器。 一、显微镜的种类及原理 1,普雨光学显微镜 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。 它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台，调焦螺旋等部件，是 显徽镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变 的。而光学系统由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的 显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗 视野、相差等。 对任何显徽镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度看，光学显微镜的 分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 分辨*（最小可分满距离）=品 式中入为所用光源波长：6为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图2-8）： 为玻片与物镜间介质的折射率。显徽观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如空气 (n=l.0)、水(n=1.33)、香柏油(n=1.52)等。nsin9也被表示为数值孔径值(numerical aper ture,NA),它是决定物镜性能的最重要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（入=450m 作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率0.18u(表2-1)。由于肉眼的正常分辨能力一股为 0.25mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到1000~1500倍，在此基础上进 步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。 工作距离 供 图2-8曼微镜的数值孔径值与镜口角及工作距离间的关系 2.暗视野显微镜 明视野显微镜的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是 透明的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿 过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜（图2一9），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的 正如我们在白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品 与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗
.22. 第二章微生物的纯培养和显微技术 表2一1不同里微镜物镜的特性比较 物镜 特性 搜素物镜低倍镜 高倍镜 油镜 放大倍数 4× 10× 40-45× 90-100× 数值孔径值 0.10 0.25 0.55-0.65 1.25-.4 焦深 16 mm 1.8-2.0nm 工作距离 17-20mm 4-8mm 0.5-0.7mm0.1mm 蓝光(450nm时可以达到的分辨率2.3m 0.9m 0.35m 0.18m 粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存 在：因此，暗视野法主要用干观察生活细曹的运动性。 图2一9明视野（左）与暗视野（右）的照明示意图 3.相差显微镜 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振（亮度）都没有明显的变化，别此用普语 光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细 胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别随者 光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉 不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置—环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的 相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对 比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人 们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清 的活细胞及细胞内的某些细徽结构，是显微技术的一大突破，为此，其发明人F,mike获得了 1953年的诺贝尔物理学奖。 4,荧光显微镜 有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分光波较长的可见光，这种现象称为荧光 因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显 微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光 素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免狡
第二节显镜和显微技术 ·23 学，环境微生物学、分子生物学中应用十分普遗。 5.透射电子显微镜 由干品微箭的分辩率取决干所用光的波长，人1从0世纪初开始就尝试用波长甲短的由磁波 取代可见光来放大成像，以制造分辨本领更高的显徽镜。1933年，德国人E.Ruska制成了世界」 第一台以电子作为“光源”的显微镜一电子显微镜。其理论依据是：电子束通过电磁场时会产生 复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样 可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快， 波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005m,所以电子显微镜的分辨能力要远高于 光学显微镜（图2-10）。几十年来，电子显微技术发展很快，应用也日益广泛，对包括微生物学在 内的许多学科的进步都起了巨大的推动作用。为了表影E.Ruska及后来发明扫描隧道显微镜的 G.Binning和H.Rohrer在显徽技术方面所做的开拓性工作，1986年他们三人共同获得了当年的 诺贝尔物理学奖。 @ 0 9.1 nm 1am 1onm 100nm 1um 10jm 100 pm 1mm 10mm 100mm 1 10m 通时电子显花 五电子显撒 复式光竿薇 图2-10显微镜的分排奉比较 最早由E.Ruska等发明的电镜就是透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM) 其工作原理和光学显微镜十分相似（图2-11）。但由于光源的不同，又决定了它与光学显微镜的 系列差异，主要表现在：①在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物 像散乱不清，因此电镜镜简中要求高真空；②电子是带电荷的粒子，因此电镜是用电磁图来使“光 线”汇聚、案焦：③电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 6.扫描电子显微镜 扫描电子昆微墙(sa ing electron microscope,SEM)与光学显微镜和透射电镜不同，它的工 作原理类似于电视或电传真照片。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样 品表面进行“扫描”，电子束扫到的地方就可澈发样品表面放出二次电子（同时也有一些其他信号）
·24· 第二章微生物的纯培养和显微技术 二次电子产生的多少与电子束人射角度有关，也即是与样品表面的立体形貌有关。与此同时，在观 察用的荧光屏上另一个电子束也做同步的扫描。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器变成 光信号，再经光电倍增管和放大器又变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品上产 生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就超亮，我们就能得到一幅放大的样品立体图像。 电子漂 一样品 物 中同像 投影物使 用股芳隐聚格 用2-11透射电子显顾镜工作示意图（左）和照片（右） 扫描电镜主要被用于观熹样品的表面结构。由于电子束孔径角极小，扫描电镜的暴深很大，成 像具有很强的立体感。与扫描电镜相比，透射电镜景深较小，一般只能观察切成薄片后的二维图 像。此外，在扫描电镜中，电子束的轰击使样品表面除放出二次电子外，还可产生许多有用的物理 信号，如特征性X光谱线、阴极荧光、背散射电子、俄歌电子及样品电流等。对这些信号进行分别 收巢、分析，还能得到有关样品的其他信息。例如收集X射线信号，可以对样品各个微区的元素组 成进行分析。 7,扫描楼道显微镜 在光学显徽镜和电子显微镜的结构和性能得到不断完善的同时，基于其他各种原理的显微镜 也不断问世，使人们认识微魂世界的能力和手段得到不断提高。其中20世纪80年代才出现的扫 描隧道显徽镜(scanning tunneling,STM)是显徽镜领域的新成员，主要原理是利用了蕾 子力学中的隧道效应。 STM有一个半径极细的金属探针，其针尖通常小到只有一个原子，可利用压电陶瓷将其推进 到待测样品表面很近的距离(0.5~2m)进行扫描。在这样近的距离内，针尖顶部可以接触到样 品表面的电子云，但又不致损坏样品。此时在探针和样品之闻加零点几伏的电压，将有钠安级的电