第二节显微镜和显微技术 ·25· 流产生，这电流就是隧道效应电流。该电流对针尖至样品表面的距离非常敏感。当距离改变一个 原子台阶的大小(0.3m),电流将改变1000倍。利用电子学反馈控制系统保持探针扫描时的电 流或高度恒定，就可以通过记录电压或电流的变化而了解样品的表面形貌。 STM的横向分辨率可以达到0.1~0.2nm,纵向分辨率可以达到0.001nm,是目前分辨率最 高的显微镜，足以对单个的原子进行观察。此外，由于STM在扫描时不接触样品，又没有高能电 子束轰击，原则上讲可以避免样品的变形。而且，它不仅可以在真空，而且可以在保持样品生理条 件的大气及液体环境下工作。因此，STM对生命科学研究领峨具有十分重要的意义。目前，人们 已利用STM直接观察到DNA,RNA和蛋白质等生物大分子，及生物膜、古生菌的细胞壁、病毒等 结构。 近年来，在STM的基础上又发展出了另一种打描探针式显微镜，原子力显微镜(atomic force Spe,AFM)。AFM也是利用细小的探针对样品表面进行恒定高度的扫描来对样品进行“观 察”，但它不是通过隧道电流，而是通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获取样 品表面形貌的信息，因此，与STM不同，AFM可以用于对不具导电性，或导电能力较差的样品进 行观察。 二、显微观察样品的制备 样品制备是显做技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一般来说，在利用显 微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点采用合适的制样方法外，还应考虑生 物样品的特点，尽可能地使被观察样品的生理结构保持稳定，并通过各种手段提高其反差。 【光学是微镜的制样 光学显徽镜是微生物学研究的最常用工具，有活体直接观寒和染色观赛二种基本使用方法。 (1)活体观察 可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗视野或相差显微镜下对徽生物活体进行直 接观寨。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门 研究微生物的运动能力、摄食特性及生长过程中的形态变化，如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程 ①压滴法将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察。 ②悬滴法在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹载玻片上后进行显微镜观察 为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林。 ③菌丝埋片法将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或南孢子悬液，经培养，取下 玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。 (2)垫色观察 般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其背景相差很 小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时只能看到其大体形态和运动情况。若要在光学是微镜下观 察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观样品不 同部位的反差。 染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻 片上，二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定二种方法。固定时应注意尽 量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。而染色则根据方法和染料等的不同可分为很多种类
、·26 二章微生物的纯培养和显微技术 如细菌的染色，可简单概括如下： /简单染色法 正染色 革兰氏染色法 鉴别染色法 抗酸性染色法 死酒 芽孢染色法 细菌染色法 姬姆萨染色法 负染色：荚膜染色法等 活菌：用美蓝或TTC(氧化三苯基四氮唑)等作活菌染色 2.电子显微镜的制样 生物样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱水，失去样 品原有的空间构型。此外，由于构成生物样品的主要元素对电子的散射与吸收的能力均较弱，在制样时 ·船都需要采用重金属款垫鱼或魔镀以棉高其在电静下的反兽形成明暗清晰的电子图像。 (1)透射电镜的样品制备 电子的穿透能力有限，因此透射电镜采用覆盖有支持膜的载网来承戟被观察的样品。最常用 的载网是铜网，也有用不锈钢、金、银、镍等其他金属材料制备的鞍网。而支持膜可用塑料膜（如火 棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等)，也可以用碳膜或者金属膜（如皱膜等）。 ①负染技术与将样品本身染色来提高反差的方法相反，负染色技术是用电子密度高，本身 不显示结构且与样品儿乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来对样品进行“染色”。这些重金 属盐不被样品成分所吸附而是沉积到样品四周，如果样品具有表面结构，这种物质还能进入表面上 凹陷的部分，从而可以通过散射电子能力的差异把样品的外形与表面结构清楚地村托出来（图2 12)。负染技术简便易行，病毒、细菊（特别是细菊鞭毛）、离体细胞器、蛋白质和核酸等生物大分子 等的形态大小和表面结构都可以采用这种制样方法进行观察。实际操作时，既可把样品和重金属 染料混匀后滴加到支特摸上，也可将样品用贴印或喷雾的方法加到载网上后再用染料进行染色 而对于核酸分子，为避免其结构在进行制样时遭到坏，通常采用蛋白质单分子膜技术。其原理是 将核酸与少量球状蛋白（如细胞色素）混合后，通过干净的玻璃斜面滑人装在烧杯或平皿中的缓 冲液中使其在溶液表面形成不溶的变性薄膜，控制适当的条件这一薄膜可以成为单分子层。当核 酸分子与该蛋白质单分子膜作用时，会由于蛋白质的氨基酸碱性侧链基团的作用，使得核酸被拉成 细丝状，并从形态到结构均能保持一定程度的完整性。然后再将吸附存核酸分子的蛋白质单分子 膜转移到载膜上进行负染色后观察。 ②投影技术在直空蒸发设备中将铂成铭等对电子散射能力按强的金属原子，由样品的斜 方进行喷镀，提高样品的反差。如图2-13所示，样品上喷镀上金属的一面散射电子的能力强，表 现为暗区，而没有喷镀上金属的部分散射电子能力弱，表现为亮区，其教果就如同太阳光斜射形成 的影子，使我们能了解样品的高度和立体形状。投影法可用于观察病海、细菌鞭毛、生物大分子等 微小颗粒
第三节显微镜下的微生物 27 人9 支持 持 长 0:投影角：腋头是投影方向 图2-12负染技术 图2-13投影技术 ③超薄切片技术尽管微生物的个体通常都极其微小，但除病毒外，微弱的电子束仍无法透 过一般微生物如细菌的整体标本，需要制作成1O0m以下厚度的超薄切片，方能看清其内部的细 微结构。此外，从细菌、立克次氏体、螺旋体、病毒等病原体与宿主细胞的关系，对宿主细胞引起的 超微形态的改变，以及如病毒对宿主细胞的吸附、进人、繁殖等机理的研究，也都需要将宿主的组织 或培养细胞制作超薄切片后才能用透射电镜观察。可以说，超薄切片技术是生物学中研究细胞及 组织超徽结构的最常用、最重要的电镜样品制备技术，其基本操作步骤如下。 取样一固定→脱水→没透与包埋→切片→捞片→染色→观察 (2)扫描电镜的样品制备 扫描电镜的结构特点是利用电子束作光栅状扫描以取样品的形貌信急。因此，其样品制备方 法比透射电镜要简单，它主要要求样品干燥，并且表面能够导电。对大多数生物材料来说，细胞含 有大量的水分，对表面不导电，所以观察前必须进行处理，去除水分，对表面喷镀金属导电层。在这 过程中必须始终保持样品不变形，这样，最后的观赛才能反映样品本来面目。保持样品形状的主婴 关键是样品干燥。干燥方法有自然干燥、真空干燥、冷冻干燥和临界点干燥等。其中临界点干燥的 效果最好，其原理是利用许多物质，如液态C02,在一个密闭容器中达 一定的温度和压力后，气液 相面消失（即所谓的临界点状态）的性质，使样品在没有表面张力的条件下得到干燥，很好地保持样 品的形态。干燥、喷镀金属层后的样品便可用于观察。 第三节显微镜下的微生物 微生物类群庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的做生物称为细胞 型微生物，按系统发育和细胞结构它们分属于细菌(Bacteria)、古生菌(Archaea)和真核生物(Eu kaya)。而不具细胞结构的病毒、类病毒，行奇生生活，它们的许多生活特性类同于寄主生物。本 节将主要介绍在显微镜下细胞型微生物的一般形态和细胞大小，对丰富多彩的微生物世界有一个 初步的认识。 一、细菌和古生菌 虽然从系统发育来看，细菌和古生菌是二种完全不同的生物类群，但它们的细胞结构却基本 致，同属原核生物(Prokaryote),在显微镜下的形态也十分类似
·28 第二章微生物的纯名养和显微技术 1.细菌的形态和排列 在显微镜下不同细菌的形态可以说是干差万别，丰高多彩，但就单个有机体而言，其基本形态 可分为球状、杆状与螺旋状三种（困2一14）。尽管是单细胞生物，许多细蘭也常以成对、成链、成镇 的形式生长，例如双球菌（图2-15一肺炎球，旧称肺炎双球菌）、链球曹（图2-16）、四联球菌、 八叠球菌、葡萄球等。 螺旋 图2-14细菌的三种基本形态（左为模式图，右为照片 图2-15肺炎球菌( cc2 s pneumoniae) 图2一16链球随(Sbgm】 除了球菌，杆菌、螺旋菌三种基本形态外，还有许多具其他形态的细蓝。例如柄杆菌细胞上有 柄(stalk)、菌丝((hyphae)、附器(appendages)等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细 柄（图2-17）；球衣菌(Sphaerotilus),能形成衣箱(sheath),杆状的细胞呈徒状排列在衣箱内而成 为丝状（图2-1l8);而支原体(Myoplasma)由于只有细胞膜，没有细胞壁，故细胞柔软，形态多变，具
第三节显微镜下的微生物 ·29 有高度多形性。即使在同一培养基中，细胞也常出现不同大小的球状、环状、长短不一的丝状、杆状 及不规则的多边形态（图2-19）。另外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌（图2-20）。 图2-17柄细菌的特征形态电镜照片 a.双稍不粘杆(）b.离臂徽(adetum)c.普氏绿 臂蓝(Ancalochloris per filievii)d.柄杆曹(Caulobacter sp.) 图2-18箭衣菌Sphaerotilus natans a.相差显微镜照片b.透射电镜超薄切片 有些细菌具有特定的生活周期，在不同的生长阶段具有不同的形态，例如放线菌，粘细菌等。 放线菌是生产抗生素的重要微生物，大多由分枝发达的菌丝组成。而根据菌丝的形态和功能又可 分为营养菌丝、气生茵丝和孢子丝三种，其中孢子丝的形态特征是放线菌的重要鉴定指标（图2一 21,2-22)。 细菌的形态明显地受环境条件的影响，如培养时间、培养温度、培养基的组成与浓度等发生改 变，均能引起细曹形态的改变。一般处于幼翰阶段和生长条件适宜时，细菌形态正常、整齐，表现出 特定的形态。在较老的培养物中，或不正常的条件下，细胞常出现不正常形态，尤其是杆菌，有的细 胞膨大，有的出现梨形，有的产生分枝，有时菌体显著伸长以至呈丝状等。这些不规则的形态统称 为异常形态，若将它们转移到新鲜培养基中或适宜的培养条件下又可恢复原来的形态