弟一节微生物的分霄和纯培养 ·15 0.1ml 涂布平板法 染希梦 甲草装提幸终 稀释倒平板法 a销我智 禁安母0爽究的背 鲤英簧发塞 图2一4稀释后用平板分离细随单菌落 3.平板划线分离法(streak plate method) 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他 形式的连续划线（图2一5），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果 划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单蓝落。 4.稀释摇管法(dilution shake culture method) 用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可 以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学，物理或生 物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养 法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式”。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使晾脂 熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷 凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后 菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡 石结盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养 皿中，用无蓝刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。 三、用液体培养基分离纯培养 对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上 长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌 许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。 通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到 高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物 生长，那么有微生物生长的试管得到的培莽物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生 的至来可果用欧电方隆来老行格天直外肉州化，海H技米有职限平爱省木，他对技行很木的大发量老有锐青
·16 第二章生物的纯培养和显微技术 图2-5平板划线分离法 形划线b连续划线。，方格划线.刘线分 离培养后平板上示的菌落照片 图2-6用稀释摇管法在球脂柱中形成的菌落照片。 (从右至左稀释度不断提高) 物生长的比例提高了，得到纯培养物的概率就会急刷下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须 在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。 四、单细胞（单孢子）分离 稀释法有一个重要快点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很 多嫩生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或 单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个 体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌侧较难
第一节搬生物的分离和纯培养 .17 对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除 去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显徽镜下进行。对于个体相对较小的微 生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过 机械、空气或油压传动装置来诚小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显徽针、钩、环等挑取单个 微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进 行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液清在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液 滴来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学 研究中采用。 五、选择培养分离 没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有 的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种徽生物，只有能生长的才生长，其他被抑制。如 果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种徽生物的生长，因 而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种徽生物选择培养出来，即使在混杂的徽生物群体中这 种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是 十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的徽生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在 大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的。因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分 困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方 法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中的徽生物数量在10时，必须稀释到 10~·才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的徽生物的数量仅为10一10，显然不可能在 般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营 养，生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数徽生物不能生长，或适成有利于 该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进 行纯培养分离 1.利用选择培养基进行直接分离 主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中 筛选蛋白酶产生随时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白 酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解 圖对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘次：再如，要分离高温 菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上进行分离：有些 微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行 分离纯化，因为滑行能使它们自己和其他不能移动的徽生物分开，可将微生物群落点种到平板上 让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。 2.富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的 做生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的 特定微生物。富巢条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选 择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。图2-7描述了采用高樂方法从土
·18· 第二章微生物的纯培养和显微技术 壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸(-hydroxybenzyl acid)的微生物的实验过程。首先配制 以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液 体培养基中，培养一定时问，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取少量上 述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比 例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物 苗落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对 羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有 对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物 通过高集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或 平板划线等操作得到纯培养物 富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的儿乎无穷尽的组合形式 可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。言集培莽方法提供了按照意愿从自然界分离出特定 已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培 养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么徽生物能在这种特定的 环境中生长。 粉债+ 辛使装紧 择我壁森赞禁代 色童天 鞋骑健释 图2-7利用高巢培养技术从土壤中分离能降解对羟基甲酸的微生物 六、二元培养物 分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难做到的。但可 用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上激 生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间 的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细 胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的徽生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物， 或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培 养的培养方法。 在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原 生动物和它猎食的微生物二者组成，例如，纤毛虫，变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并 不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其普养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很 困难、很费事
第一节微生物的分离和纯培养 ·19 七、微生物的保藏技术 通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在 一定时间内不死亡，不 会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究 和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍 贵的自然资源，具有重要意义。许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏 委员会(COCCM),中国典型培养物保藏中心(CCTCC),美国典型菌种保藏中心(ATCC),美国的北 部地区研究实验室(NRRL),荷兰的霉菌中心保藏所(CBS),英国的国家典型菌种保藏中心 (NCTC)以及日本的大版发酵研究所(IFO)等。国际微生物学联合会(IAMS)还专门设立了世界菌 种保藏联合会(W℉GC),用计算机储存世界上各保藏机构提供的带种数据资料，可以通过国际互联 网查询和素取，进行微生物菌种的交流、研究和使用。 生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是 根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如利用培养 基或宿主对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光，缺乏营 养等，令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保 存，有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力 1,传代培养保藏 传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保戴的基本方法。常用的有琼脂斜面 半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保素微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培 养基，并在规定的时间内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物 菌种。在琼脂斜面上保藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数 一般来说，通过降低培养物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。例如在菌 株生长良好后，改用橡皮塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡，并放置低温保存：将一些菌的菌苔 直接刮入蒸馏水或其他缓冲液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效 果，这种方法有时也被称为悬液保藏法。 由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退， 使蘭株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代 法对常用的菌种进行保存外，还必须根据条件采用其他方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更 是如此。 2.冷冻保藏 将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进 行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因是低温会 使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法 可因产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温 也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5m心/L左右的甘 油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞：大分子物质如糊精、血清蛋白、脱 脂牛奶或聚乙烯吡略烷酮(PVP)虽不能透人细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受 冻伤。因此，在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率