国家自然科学基金申请书 受体亚型具有各自独特的转录激活区域,以及不同的组织分布,可能是靶组织对E呈现不同反应的 关键因素。因此,药物对PMO的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化 合物—— Estren,可能通过激活MAK途径,防治PMo而无刺激子宫内膜增生的作用,为实现这一 理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径 RNAi(RMA干扰)技术通过双链RNA(dsRM)引发转录后沉默,产生RNAi现象12)。该技术具有 高度的序列专一性,可使特定基因不表达,比反义RNA技术和同源共抑制更有效,更容易产生功能丧 失或降低突变,目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析,从而成为一种抑制 体细胞功能基因翻译表达的有效工具13)。将药物作用下的优势ER亚型选择性地抑制表达,可有效地 分析ER介导药物作用的机制,国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。 参考文献 1.王玉东,李大金:绝经后骨质疏松症发生的分子机制。中华老年医学杂志2003;22(3):187 2.王文君,俞瑾,王静:“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学 学报2000;27(1):54-6 3.王文君,俞瑾,王静:中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药 杂志2001;35(11)46-9 4.李大金李超荆俞瑾等:中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节.上海免疫学 杂志195,15(5)257-60 5.王文君俞谨,李大金中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞ER及Ⅱ-2、TNF活性的影响生 殖与避孕1996;16(4):263-7 6.廖二元骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志2002;18(2):87-9 7. Martin Enserink. The Vanishing Promises of Hormone Replacement. Science 2002; 297: 325-6 8.王玉东,李大金补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用.中国中西医结合杂志2004(待发 表) 9. Fiore CE, Pennisi P, Tandurella FG et al. Response of biochemical of bone turnover to estrogen treatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation Endocrinol Invest 2001; 24(6): 423-9 10. Gilles B. Tremblay l, Andre Tremblay l, Neal G. Copeland, et al. Cloning, Chromosomal Localization, and Functional Analysis of the Murine Estrogen Receptor B. Molecular Endocrinology 1997; 11(3) 353-65 11. Miller G. Divorcing estrogen,'s bright and dark sides. Science 2002: 298: 723-4 12. Phillip D. Zamore, Thomas Tuschl, Phillip A. Sharp. RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell 2000: 101: 25-33 13. Morita T, Yoshida K. RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002 47(14): 1839-45 第6页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.018.551 受体亚型具有各自独特的转录激活区域，以及不同的组织分布，可能是靶组织对 E 呈现不同反应的 关键因素（10）。因此，药物对 PMO 的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化 合物——Estren，可能通过激活 MAPK 途径，防治 PMO 而无刺激子宫内膜增生的作用，为实现这一 理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径（11） 。 RNAi（RNA干扰）技术通过双链RNA（dsRNA）引发转录后沉默，产生RNAi现象（12）。该技术具有 高度的序列专一性，可使特定基因不表达，比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧 失或降低突变，目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析，从而成为一种抑制 体细胞功能基因翻译表达的有效工具（13）。将药物作用下的优势ER亚型选择性地抑制表达，可有效地 分析ER介导药物作用的机制，国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。 参考文献 1. 王玉东，李大金：绝经后骨质疏松症发生的分子机制。 中华老年医学杂志 2003；22（3）：187 －8 2. 王文君，俞瑾, 王静：“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学 学报 2000；27（1）：54-6 3. 王文君，俞瑾,王静：中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药 杂志 2001;35(11):46-9 4. 李大金,李超荆,俞瑾等: 中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节. 上海免疫学 杂志 1995; 15(5):257-60 5. 王文君,俞谨, 李大金. 中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞 ER 及 IL-2、TNF 活性的影响.生 殖与避孕 1996；16（4）：263-7 6. 廖二元.骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志 2002；18（2）：87-9. 7. Martin Enserink. The Vanishing Promises of Hormone Replacement. Science 2002; 297: 325-6. 8. 王玉东，李大金. 补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用. 中国中西医结合杂志 2004 (待发 表) 9. Fiore CE, Pennisi P, Tandurella FG, et al. Response of biochemical of bone turnover to estrogen treatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation. J Endocrinol Invest 2001; 24(6): 423-9. 10. Gilles B. Tremblay1, André Tremblay1, Neal G. Copeland, et al. Cloning, Chromosomal Localization, and Functional Analysis of the Murine Estrogen Receptor ß. Molecular Endocrinology 1997; 11 (3): 353-65. 11. Miller G. Divorcing estrogen's bright and dark sides. Science 2002; 298:723-4. 12. Phillip D. Zamore, Thomas Tuschl, Phillip A. Sharp. RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell 2000; 101:25–33. 13. Morita T, Yoshida K. RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes. Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002;47(14):1839-45
国家自然科学基金申请书 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题 【建立假设】 补肾宁心方能防治PMO而少见ERT样副作用。该方对老年大鼠外周血E水平无明显影响,但可 增强ER的表达,具有促进OB增殖和抗凋亡作用。因此,该方通过哪种ER亚型、介导何种信号转 导途径发挥选择性作用,是本题亟待解决的问题。 【研究目标】 (1)观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响:比较该方对骨与子宫 作用的差异。 (2)体外培养OB,分析正常及药物血清作用下优势表达的ER亚型。 (3)建立优势ER亚型沉默表达的人0B细胞系(MG63)和人子宫内膜癌细胞系(HEC1-B),结合 抗ER亚型与抗AR(雄激素受体)单抗对信号传导途径的阻断作用,确定在骨及子宫内膜 中发挥重要作用的ER亚型及其信号转导途径 【研究内容】 (1)补肾宁心复方灌服PMo模型BALB/c小鼠12周,处死后取椎骨测定BD、形态计量、原位分 析OB凋亡,称量子宫湿重;制备药物血清,测定E2、脱氢表雄酮 (DHEA):取脾脏免疫活性 细胞分析Th/Th2型细胞因子的表达水平;取颅骨植块法培养,观察骨片融合时间、OB增 殖能力的变化 (2)透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列,OB形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子 宫内膜制备微粒体,分析芳香化酶活性。取胫骨,提取总RNA,分析骨吸收抑制因子(OPG) 和优势表达的ER亚型。 3)取新生BALB/c小鼠颅骨酶解法培养B,体外模拟雌激素撤退现象,予以药物血淸局部干预, 观察优势表达的ER亚型及0B增殖能力的改变 (4)扫描优势ER亚型编码区基因中的A序列,据其皿RNA低二级结构的区域设计 SiRNA,用T7 体外转录 SIRNA,纯化并转染hG63和HC1-B细胞系,建立优势ER亚型沉默表达的细胞系, 分析该亚型缺失(或低表达)对pRK1/2(MAPK途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶)的 【拟解决的关键问题】 (1)分析OB优势表达的ER亚型及其胞内信号转导途径,阐明中药复方治疗PMO的作用机制。 (2)通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用,使有效治疗PM0而避免HRT样副作用成为 可能,从而深化中医药的药物归经理论 第7页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.018.551 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 【建立假设】 补肾宁心方能防治 PMO 而少见 ERT 样副作用。该方对老年大鼠外周血 E2水平无明显影响，但可 增强 ER 的表达，具有促进 OB 增殖和抗凋亡作用。因此，该方通过哪种 ER 亚型、介导何种信号转 导途径发挥选择性作用，是本题亟待解决的问题。 【研究目标】 （1） 观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响；比较该方对骨与子宫 作用的差异。 （2） 体外培养 OB，分析正常及药物血清作用下优势表达的 ER 亚型。 （3） 建立优势 ER 亚型沉默表达的人 OB 细胞系（MG63）和人子宫内膜癌细胞系（HEC1-B），结合 抗 ER 亚型与抗 AR（雄激素受体）单抗对信号传导途径的阻断作用，确定在骨及子宫内膜 中发挥重要作用的 ER 亚型及其信号转导途径。 【研究内容】 （1） 补肾宁心复方灌服 PMO 模型 BALB/c 小鼠 12 周，处死后取椎骨测定 BMD、形态计量、原位分 析 OB 凋亡，称量子宫湿重；制备药物血清，测定 E2、脱氢表雄酮(DHEA)；取脾脏免疫活性 细胞分析 Th1/Th2 型细胞因子的表达水平；取颅骨植块法培养，观察骨片融合时间、OB 增 殖能力的变化。 （2） 透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列，OB 形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子 宫内膜制备微粒体，分析芳香化酶活性。取胫骨，提取总 RNA，分析骨吸收抑制因子（OPG） 和优势表达的 ER 亚型。 （3） 取新生 BALB/c 小鼠颅骨酶解法培养 OB，体外模拟雌激素撤退现象，予以药物血清局部干预， 观察优势表达的 ER 亚型及 OB 增殖能力的改变。 （4） 扫描优势 ER 亚型编码区基因中的 AA 序列，据其 mRNA 低二级结构的区域设计 siRNA，用 T7 体外转录 siRNA，纯化并转染 hMG63 和 HEC1-B 细胞系，建立优势 ER 亚型沉默表达的细胞系， 分析该亚型缺失（或低表达）对 pERK1/2（MAPK 途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶）的 影响。 【拟解决的关键问题】 （1） 分析 OB 优势表达的 ER 亚型及其胞内信号转导途径，阐明中药复方治疗 PMO 的作用机制。 （2） 通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用，使有效治疗 PMO 而避免 HRT 样副作用成为 可能，从而深化中医药的药物归经理论