第38卷第2期Vol 38,Issue 2中国中药杂志2013年1月January, 2013·药代动力学·中药复方药物动力学总量统计矩法的实验验证研究贺福元12,3*，邓凯文*，刘文龙"，石继连"，伍勇，刘伟"，贺庆平"，李博（1.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208；2.中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南长沙4102083.湖南中医药大学现代中药制技术与评价实验室，湖南长沙4102084.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）[摘要】目的：对已建立的药物动力学总量统计矩法用补阳还五汤中黄芪甲苷、芍药苷、川芎嗪3个成分进行验证，建立中药复方多成分体系的药物动力学实验方法。方法：采用反相高效液相色谱法测定，其条件为Cls色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）：黄芪甲苷ELSD测定：流动相乙→1%乙酸溶液（35:65），流速1mL：min*：柱压（15.0±0.408）MPa：温度30℃：荐药苷、川芎嗪的检测波长254nm，流动相甲醇-水（33:67），流速1mL：min：柱压（20.71±0.42）MPa。单个成分房室模型药物动力学参数采用DAS软件处理，总量统计矩按公式计算。结果：3个单成分在大鼠体内药物动力学都遵循二室模型（P<0.01），与叠加总浓度比，单个成分各参数相差最大上万倍，而总量统计矩参数的RSD为3.5%，3个成分药物动力学的总量统计矩参数AUC（119.8±27.20）gmin·L-;MRT,（210.0±54.49）min；VRT,（5.608±2.723）×10*min2：CL为(0.3196±0.0688）mLmin-·kg：V,为（64.12±8.243）mL·kg：to.95为（588.9±149.4）min。这就说明3个成分总量的半衰期为（145.5±37.76）min，3药在0~674.2min内代谢95%的浓度。结论：中药复方多成分药物动力学可采用总量统计矩法进行研究，该法能表征多成分体系总量的量时变化的动力学规律。[关键词】总量统计矩：药物动力学：谱动学：补阳还五汤：黄芪甲苷：芍药苷：川芎嗪中药及复方药物动力学研究是阐明中药复方产采用难度，为此，本论文先从第一个问题着手，详细生作用物质基础的关键问题，是阐明机体对中药及阐明建模的思路及参数的意义及测定方法，再逐步报道其相关问题。复方量时效关系的基础，也是中药复方制成控缓释制剂的理论基础。由于中药复方为多成分体补阳还五汤系清代王清任《医林改错》首载，该方由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成，系，如按单成分药物动力学研究将会存在以下问题2-]：①怎样建立适宜多成分药物动力学研究的数具有补气、通络的功能。在抗血栓、抗脑栓血、抗衰老、抗血脂及免疫功能方面都有广泛的作用。本学模型，并对参数进行测定：②在对照品缺少的情况下，中药复方多成分怎样进行药物动力学研究：③怎室对该方进行了大量的抗脑血栓作用机制研究，发样建立宏观综合效应与总成分、单成分浓度对应关现该方具有重要的抗血栓活性作用。其主要有效成系。针对这些问题，作者前期创立了总量统计矩法，分部位为总、总苷元、总生物碱和总多糖，其代表性并有论文发表和成果获奖，但由于公式推导较复成分为黄芪甲苷、芍药苷、川芎嗪等等，本文选这3个杂，参数的理论与实验测定问题没有深入阐明清楚，成分作为代表性成分来阐明中药复方多成分如何进行可能会影响同行在进行中药复方药物动力学研究时以总量统计矩数学模型为基础的药物动力学研究。1多成分药物动力学的建模数学思路[稿件编号］20120524002多成分的药物动力学研究是回答各成分浓度随[基金项目】国家自然科学基金项目（81073142，30901971）：湖南时间量变规律，总体上有2种思路，一种是根据药物省自然科学基金重点项目（11JJ2055）：湖南省教育厅“十二五”药学浓度具有叠加性，可将各单成分浓度直接相加构成重点学科项目[通信作者]贺福元，教投，博士生导师，主要从事中药药理学、谱总量药物浓度，然后再按单成分药物动力学方法进动学、谱效学、谱效动力学、谱量学、中药药剂学及中医药信息数学研行参数求算，这种方法能获得总量药物动力学参数，究工作，Tel:(0731)85381372，13787213681，E-mail:pharmsharking@但会丢失各成分的药物动力学参数，没有建立起总tom. com·253
·药代动力学· 中药复方药物动力学总量统计矩法的实验验证研究 贺福元1，2，3* ，邓凯文4 ，刘文龙1 ，石继连1 ，伍勇1 ，刘伟1 ，贺庆平1 ，李博1 ( 1. 湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208; 2. 中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南 长沙 410208; 3. 湖南中医药大学 现代中药制技术与评价实验室，湖南 长沙 410208; 4. 湖南中医药大学 第一附属医院，湖南 长沙 410007) ［摘要］ 目的: 对已建立的药物动力学总量统计矩法用补阳还五汤中黄芪甲苷、芍药苷、川芎嗪 3 个成分进行验证，建立 中药复方多成分体系的药物动力学实验方法。方法: 采用反相高效液相色谱法测定，其条件为 C18色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm， 5 μm) ; 黄芪甲苷 ELSD 测定; 流动相乙腈-1% 乙酸溶液( 35∶ 65) ，流速 1 mL·min － 1 ; 柱压 ( 15. 0 ± 0. 408) MPa; 温度 30 ℃ ; 芍 药苷、川芎嗪的检测波长 254 nm，流动相甲醇-水( 33∶ 67) ，流速 1 mL·min － 1 ; 柱压( 20. 71 ± 0. 42) MPa。单个成分房室模型药 物动力学参数采用 DAS 软件处理，总量统计矩按公式计算。结果: 3 个单成分在大鼠体内药物动力学都遵循二室模型( P ＜ 0. 01) ，与叠加总浓度比，单个成分各参数相差最大上万倍，而总量统计矩参数的 RSD 为 3. 5% ，3 个成分药物动力学的总量统 计矩参 数 AUCt ( 119. 8 ± 27. 20 ) g · min · L － 1 ; MRTt ( 210. 0 ± 54. 49 ) min; VRTt ( 5. 608 ± 2. 723 ) × 104 min2 ; CLt 为 ( 0. 319 6 ± 0. 068 8) mL·min － 1 ·kg － 1 ; Vt为( 64. 12 ± 8. 243) mL·kg － 1 ; t0. 95t为( 588. 9 ± 149. 4) min。这就说明 3 个成分总 量的半衰期为( 145. 5 ± 37. 76) min，3 药在 0 ～ 674. 2 min 内代谢 95% 的浓度。结论: 中药复方多成分药物动力学可采用总量 统计矩法进行研究，该法能表征多成分体系总量的量-时变化的动力学规律。 ［关键词］ 总量统计矩; 药物动力学; 谱动学; 补阳还五汤; 黄芪甲苷; 芍药苷; 川芎嗪 ［稿件编号］ 20120524002 ［基金项目］ 国家自然科学基金项目( 81073142，30901971) ; 湖南 省自然科学基金重点项目( 11JJ2055) ; 湖南省教育厅“十二五”药学 重点学科项目 ［通信作者］ * 贺福元，教授，博士生导师，主要从事中药药理学、谱 动学、谱效学、谱效动力学、谱量学、中药药剂学及中医药信息数学研 究工作，Tel: ( 0731) 85381372，13787213681，E-mail: pharmsharking@ tom. com 中药及复方药物动力学研究是阐明中药复方产 生作用物质基础的关键问题，是阐明机体对中药及 复方量-时-效关系的基础，也是中药复方制成控缓 释制剂的理论基础［1］。由于中药复方为多成分体 系，如按单成分药物动力学研究将会存在以下问 题［2-5］: ①怎样建立适宜多成分药物动力学研究的数 学模型，并对参数进行测定; ②在对照品缺少的情况 下，中药复方多成分怎样进行药物动力学研究; ③怎 样建立宏观综合效应与总成分、单成分浓度对应关 系。针对这些问题，作者前期创立了总量统计矩法， 并有论文发表和成果获奖［6］，但由于公式推导较复 杂，参数的理论与实验测定问题没有深入阐明清楚， 可能会影响同行在进行中药复方药物动力学研究时 采用难度，为此，本论文先从第一个问题着手，详细 阐明建模的思路及参数的意义及测定方法，再逐步 报道其相关问题［7］。 补阳还五汤系清代王清任《医林改错》首载，该 方由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成， 具有补气、通络的功能。在抗血栓、抗脑栓血、抗衰 老、抗血脂及免疫功能方面都有广泛的作用［8］。本 室对该方进行了大量的抗脑血栓作用机制研究，发 现该方具有重要的抗血栓活性作用。其主要有效成 分部位为总苷、总苷元、总生物碱和总多糖，其代表性 成分为黄芪甲苷、芍药苷、川芎嗪等等，本文选这 3 个 成分作为代表性成分来阐明中药复方多成分如何进行 以总量统计矩数学模型为基础的药物动力学研究。 1 多成分药物动力学的建模数学思路 多成分的药物动力学研究是回答各成分浓度随 时间量变规律，总体上有 2 种思路，一种是根据药物 浓度具有叠加性，可将各单成分浓度直接相加构成 总量药物浓度，然后再按单成分药物动力学方法进 行参数求算，这种方法能获得总量药物动力学参数， 但会丢失各成分的药物动力学参数，没有建立起总 ·253· 第 38 卷第 2 期 2013 年 1 月 Vol. 38，Issue 2 January，2013
第38卷第2期Vol 38,Issue2中国中药杂志2013年1月January,2013量药物动力学参数与单个成分药物动力学参数的关.系：第二方法是进行函数曲线转换后再叠加处理，先-MRT,(3)2.将单成分药物动力学曲线转变成一种公用函数曲线，再进行曲线叠加，最常用的方法就是泰勒由上诸式可知：设M表示r室模型第i项e的（Tatlor）转换叠加：傅利叶（Fourier）转换叠加等指数项前面的系数，α，表示第i项e的幂指系数。但对转换后的叠加函数不能直接给有价的药物动力一、二、三室成分的各总量统计矩参数意义及计算参学参数，因此较宜采用统计矩转换叠加构成总量统见文献[6]。非线性模型的统计矩参数：按统计矩计矩参数，与单成分统计矩参数一样，能表征多成分原理可得到非线性单成分零、一、二阶统计矩参数通宏观的药物动力学行为。由于单成药物动力学的统式，为式(5)，(6)，(7)。计矩模型及参数已被熟悉，其总量统计矩参数也易AUC.t+(5)为大家所接受，为此可以先将单成分的药物动力学V+2V.统计矩化，亦正态分布曲线化，然后再进行叠加构成2cg+9kgco+12kz(6)MRT, =总量统计矩参数，亦总量正态分布曲线化，由此可得V_(12k+6c)总量零、一、二阶矩参数。因此总量统计矩参数既能2cg +85kgco +20k.cg +180k.co +144kmVRT, =3(7)36V(2k+c)2反映总量药物浓度的动力学行为，又能与单个成分的统计矩参数关联，可用于房室、非房室及不规则成各总量统计矩参数意义及计算参见文献6]。分的药物动力学研究，是整合多成分药物动力学较不规则模型的统计矩参数：按统计矩参数定义，宜的数学处理方法。用梯形法或抛物线法计算零阶矩（AUC），按文献的1.1单成分的统计矩将单成分的药物动力学曲先计算AUMC（时间与曲线乘积下的面积），再计算MRT，再计算AUVC（时间平方与曲线乘积下的面线（参数）转变成统计矩曲线（参数）。其思路见图积），再计算VRT。1。单成分药时曲线的统计矩化过程实际上就是将1.2多成分体系的药动学总量统计矩参数的设定药物动力学曲线转变成正态分布曲线，其中重要参数有零阶矩（AUC）、一阶矩（MRT）和二阶矩及与单个成分指标的关系根据统计矩原理进行加(VRT)。合处理，见图2，图中分别为2个成分的统计矩曲线，经统计矩原理加合计算后可得图中b的总量统计矩曲线，由此可得总量统计矩参数：总量零阶矩AUC，、总量一阶矩MRT、总量二阶矩VRT。假设中药复方为一个由n个单体成分群构成体系，其中m个成分服从线性药物动力学。第i个成分服从ri室模型。S.个成分服从非线性药物动力学。S,个为不a药物动力学曲线：b.统计矩曲线。图1药物动力学曲线（参数）转变成统计矩曲线（参数）规则模型，该中药复方成分总量的零阶矩、一阶矩、Fig.1Statistical moment cuvers (parameters)translated from二阶矩及由此衍生的一系列动力学参数概念如下。pharmacokinetic cuvers (parameters)线性房室模型的统计矩参数：按统计矩原理可MRT,VRT得到单成分零、一、二阶统计矩参数通式，为式（1），(2),(3)。tM.2(1)AUC,=a整合前2药的总量统计矩正态曲线b.整合后2药的总量统计矩正态曲线。(2)MRT, =图2统计矩的加合性Fig.2Adding property for statistical moment·254·
量药物动力学参数与单个成分药物动力学参数的关 系; 第二方法是进行函数曲线转换后再叠加处理，先 将单成分药物动力学曲线转变成一种公用函数曲 线，再进行曲线叠加，最常用的方法就是 泰 勒 ( Tatlor) 转换叠加; 傅利叶( Fourier) 转换叠加等［9］， 但对转换后的叠加函数不能直接给有价的药物动力 学参数，因此较宜采用统计矩转换叠加构成总量统 计矩参数，与单成分统计矩参数一样，能表征多成分 宏观的药物动力学行为。由于单成药物动力学的统 计矩模型及参数已被熟悉，其总量统计矩参数也易 为大家所接受，为此可以先将单成分的药物动力学 统计矩化，亦正态分布曲线化，然后再进行叠加构成 总量统计矩参数，亦总量正态分布曲线化，由此可得 总量零、一、二阶矩参数。因此总量统计矩参数既能 反映总量药物浓度的动力学行为，又能与单个成分 的统计矩参数关联，可用于房室、非房室及不规则成 分的药物动力学研究，是整合多成分药物动力学较 宜的数学处理方法［6］。 1. 1 单成分的统计矩 将单成分的药物动力学曲 线( 参数) 转变成统计矩曲线( 参数) 。其思路见图 1。单成分药时曲线的统计矩化过程实际上就是将 药物动力学曲线转变成正态分布曲线，其中重要参 数有 零 阶 矩 ( AUC ) 、一 阶 矩 ( MRT ) 和 二 阶 矩 ( VRT) 。 a. 药物动力学曲线; b. 统计矩曲线。 图 1 药物动力学曲线( 参数) 转变成统计矩曲线( 参数) Fig. 1 Statistical moment cuvers( parameters) translated from pharmacokinetic cuvers( parameters) 线性房室模型的统计矩参数: 按统计矩原理可 得到单成分零、一、二阶统计矩参数通式，为式( 1) ， ( 2) ，( 3) 。 AUCri = ∑ ri i = 1 Mi αi ( 1) MRTri = ∑ ri i = 1 Mi α2 i ∑ ri i = 1 Mi αi ( 2) MRTri = 2 ∑ ri i = 1 Mi α3 i ∑ ri i = 1 Mi αi － MRT2 ri ( 3) 由上诸式可知: 设 Mi表示 ri室模型第 i 项 e 的 指数项前面的系数，αi 表示第 i 项 e 的幂指系数。 一、二、三室成分的各总量统计矩参数意义及计算参 见文献［6］。非线性模型的统计矩参数: 按统计矩 原理可得到非线性单成分零、一、二阶统计矩参数通 式，为式( 5) ，( 6) ，( 7) 。 AUCn = km c0 Vm + c 2 0 2Vm ( 5) MRTn = 2c 2 0 + 9km c0 + 12k 2 m Vm ( 12km + 6c0 ) ( 6) VRTn = 2c 4 0 + 85k 2 m c 2 0 + 20km c 3 0 + 180k 3 m c0 + 144k 4 m 36V2 m ( 2km + c0 ) 2 ( 7) 各总量统计矩参数意义及计算参见文献［6］。 不规则模型的统计矩参数: 按统计矩参数定义， 用梯形法或抛物线法计算零阶矩( AUC) ，按文献的 先计算 AUMC( 时间与曲线乘积下的面积) ，再计算 MRT，再计算 AUVC( 时间平方与曲线乘积下的面 积) ，再计算 VRT ［2］。 1. 2 多成分体系的药动学总量统计矩参数的设定 及与单个成分指标的关系 根据统计矩原理进行加 合处理，见图 2，图中 a 分别为 2 个成分的统计矩曲 线，经统计矩原理加合计算后可得图中 b 的总量统 计矩曲线，由此可得总量统计矩参数: 总量零阶矩 AUCt、总量一阶矩 MRTt、总量二阶矩 VRTt。假设中 药复方为一个由 n 个单体成分群构成体系，其中 m 个成分服从线性药物动力学。第 i 个成分服从 ri 室 模型。S1个成分服从非线性药物动力学。S2个为不 规则模型，该中药复方成分总量的零阶矩、一阶矩、 二阶矩及由此衍生的一系列动力学参数概念如下。 a. 整合前 2 药的总量统计矩正态曲线; b. 整合后 2 药的总量统计矩 正态曲线。 图 2 统计矩的加合性 Fig. 2 Adding property for statistical moment ·254· 第 38 卷第 2 期 2013 年 1 月 Vol. 38，Issue 2 January，2013
第38卷第2期Vol 38,Issue2中国中药杂志January,20132013年1月(13)t12. = 0.693MRT..1.3中药复方的总量统计矩参数包括总量统计零、总体表观消除平衡常数倒数为MRT倒数，为、二阶矩以及由此衍生的其他总量统计矩参数。式(14)。总量零阶矩（AUC）：根据统计矩的加合性可计算中药复方多成分的总量统计矩，为下式（8）。10.693(14)k.=MRT..11/2.91M+2 2km.fo.i + cal +AUC, =AUC, =MA总体表观清除率为式（15）。台2Vm.lX.oCL, = -(15)T(8)Car.gdtAIC台J式中m表示线性成分的个数，r为第i成分代总体表观分布容积为式（16）。谢的室数，s,为非线性成分的个数，s,为产生多峰不X...)×AUMC规则成分个数。(16)V, = CI, × MRT, =(SAUC)总量一阶矩（MRT）：即为总量平均驻留时间，亦为各成分的总体均值，可定义如下式（9）。95%总量与累积95%总量浓度时间区间：由于≥MRT, ×AUC,中药复方为多成分体系，用零阶矩只表征其总成分MRT,=(9)的生物利用度，用一阶矩只表征诸成分平均驻留时BAUC,间中心，这还不能完整表征多成分的药物动力学行总量二阶矩（VRT，）：亦可采用相同方法处理，为，因为平均驻留时间中心相同的一组成分其药物的可得式（10）。种类与离散程度可以不同，也就是95%总量与累积5[(MRT + VRT,)× AUC]95%时间区间不同，因此将一、二阶矩结合可表征95%台- MRT?(10)VRT,=总量浓度时间区间，亦为式（17)。2.AuCc.95%总量浓度时间区间=[MRT,-1.96VRT,，MRT,+由上诸式可知，一个复方的总体药物动力学趋1.96VRT,J(17)势由单个成分的动力学参数决定。其总量零阶矩等累积总量95%浓度时间区间=［-，a](18)于各单成分的零价矩之和：总量一阶矩等于各单个其中to.gs按累积正态分布函数求出。成分一阶矩对零阶矩的算术平均值：总量二阶矩等(r-MRT,)20.95195%=2VRT,dt(19)2元VRT/于各单个成分的一阶矩的平方与二阶矩之和对零阶矩的算术平均值，再与总量一阶矩平方之差。这些这样，式（8）～~（19）构成了中药复方多成分药性质是由总量统计矩的加合性决定的，亦有式物动力学总量统计矩数学模型及参数体系6.10]。(11),(12)。2材料与方法MRT AUG MRT, 12.1仪器与试药Agilent-200液相色谱仪：All-Z AUC, + MRT,eAUC-o+tech3300ELSD检测与UV测定。瑞士Precisa公司(11)的20A型电子天平：德国Heraeus公司的高速冷冻AUC, +VRT, + MRT ZAUC, = VRT + MRT离心机及SZ-1型快速混匀器。黄芪甲苷（批号台0110781-200512）、芍药苷（批号110736-200629）、川AUCVRT + MRT(12)营嗪（批号110817-200305）（购于国家药品生物制业品检定所），甲醇、乙睛为色谱纯，蒸馏水为二次重式中MRT，为1~i成分的总量一阶矩，VRT，为对应的总量二阶矩为：MRT，为i~n成分的总量蒸馏水，其他试剂均为分析纯。其复方药材来源为一阶矩，VRT，为对应的总量二阶矩。由总量零、一、黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus二阶矩可衍生出其它总量药物动力学参数。Bge.var.monghokicus（Bgo）Hsiao干燥根：当归为总量表观半衰期、清除率和表观分布容积：根据伞形科植物当归Angelicasinensis（Oliv）Diels的干统计矩与半衰期有关系，中药复方多成分的总量表燥根：川芎为伞形科植物川芎Ligusticumchuanxiong观半衰期为式（13）。Hort的干燥根：赤为为毛科植物芍药Paeonia.255
1. 3 中药复方的总量统计矩参数 包括总量统计零、 一、二阶矩以及由此衍生的其他总量统计矩参数。 总量零阶矩( AUCt ) : 根据统计矩的加合性可计 算中药复方多成分的总量统计矩，为下式( 8) 。 AUCt = ∑ n i = 1 AUCi = ∑ m i = 1 ∑ ri j = 1 Mi，j αi，j + ∑ s1 l = 1 2km，lc0，l + c 2 0，l 2Vm，l + ∑ s2 q = 1 ∫ ∞ 0 cnr，qdt ( 8) 式中 m 表示线性成分的个数，ri为第 i 成分代 谢的室数，si为非线性成分的个数，si为产生多峰不 规则成分个数。 总量一阶矩( MRTt ) : 即为总量平均驻留时间， 亦为各成分的总体均值，可定义如下式( 9) 。 MRTt = ∑ n i = 1 MRTi × AUCi ∑ n i = 1 AUCi ( 9) 总量二阶矩( VRTt ) : 亦可采用相同方法处理， 可得式( 10) 。 VRTt = ∑ n i = 1 ［( MRT2 i + VRTi ) × AUCi ］ ∑ n i = 1 AUCi － MRT2 t ( 10) 由上诸式可知，一个复方的总体药物动力学趋 势由单个成分的动力学参数决定。其总量零阶矩等 于各单成分的零价矩之和; 总量一阶矩等于各单个 成分一阶矩对零阶矩的算术平均值; 总量二阶矩等 于各单个成分的一阶矩的平方与二阶矩之和对零阶 矩的算术平均值，再与总量一阶矩平方之差。这些 性质是由总量统计矩的加合性决定的，亦 有 式 ( 11) ，( 12) 。 MRTt∑ n i = 1 AUCi = MRTp1∑ j l = 1 AUCl + MRTp2∑ n s = j+1 AUCs ( 11) VRTt + MRT2 t∑ n i = 1 AUCi = VRTp1 + MRT2 p1 ∑ j l = 1 AUCl + VRTp2 + MRT2 p2∑ n s = j+1 AUCs ( 12) 式中 MRTp1 为 1 ～ i 成分的总量一阶矩，VRTp1 为对应的总量二阶矩为; MRTp2为 i ～ n 成分的总量 一阶矩，VRTp2为对应的总量二阶矩。由总量零、一、 二阶矩可衍生出其它总量药物动力学参数。 总量表观半衰期、清除率和表观分布容积: 根据 统计矩与半衰期有关系，中药复方多成分的总量表 观半衰期为式( 13) 。 t1 /2，t = 0. 693MRTt，iv ( 13) 总体表观消除平衡常数倒数为 MRTt，iv倒数，为 式( 14) 。 kt，iv = 1 MRTt，iv = 0. 693 t1 /2，t ( 14) 总体表观清除率为式( 15) 。 Clt = Xo，t( i) ∑ n i = 1 AUCt ( 15) 总体表观分布容积为式( 16) 。 Vt = Clt × MRTt = Xo，t，( v) × AUMCt ( ∑ n i = 1 AUCt ) 2 ( 16) 95% 总量与累积 95% 总量浓度时间区间: 由于 中药复方为多成分体系，用零阶矩只表征其总成分 的生物利用度，用一阶矩只表征诸成分平均驻留时 间中心，这还不能完整表征多成分的药物动力学行 为，因为平均驻留时间中心相同的一组成分其药物的 种类与离散程度可以不同，也就是 95% 总量与累积 95%时间区间不同，因此将一、二阶矩结合可表征 95% 总量浓度时间区间，亦为式( 17) 。 95% 总量浓度时间区间 =［MRTt － 1. 96VRTt 1 2 ，MRTt + 1. 96VRTt 1 2 ］ ( 17) 累积总量 95% 浓度时间区间 =［－ ∞ ，a］ ( 18) 其中 t0. 95按累积正态分布函数求出。 95% = ∫ t0. 95 －∞ 1 槡2πVRT1 /2 t e － ( t－MRTt ) 2 2VRTt dt ( 19) 这样，式( 8) ～ ( 19) 构成了中药复方多成分药 物动力学总量统计矩数学模型及参数体系［6，10］。 2 材料与方法 2. 1 仪器与试药 Agilent-1200 液相色谱仪，Alltech 3300 ELSD 检测与 UV 测定。瑞士 Precisa 公司 的 20 A 型电子天平; 德国 Heraeus 公司的高速冷冻 离心机 及 SZ-1 型 快 速 混 匀 器。黄 芪 甲 苷 ( 批 号 110781-200512) 、芍药苷( 批号 110736-200629) 、川 芎嗪( 批号 110817-200305) ( 购于国家药品生物制 品检定所) ，甲醇、乙腈为色谱纯，蒸馏水为二次重 蒸馏水，其他试剂均为分析纯。其复方药材来源为: 黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus Bge. var. monghokicus ( Bgo) Hsiao 干燥根; 当归为 伞形科植物当归 Angelica sinensis ( Oliv) Diels 的干 燥根; 川芎为伞形科植物川芎 Ligusticum chuanxiong Hort 的干 燥 根; 赤芍为毛莨科植物芍药 Paeonia ·255· 第 38 卷第 2 期 2013 年 1 月 Vol. 38，Issue 2 January，2013
第38卷第2期Vol 38,Issue 2中国中药杂志2013年1月January, 2013lactloraPall的干燥根茎；桃仁为蔷薇科植物物桃统计矩参数。Prunuspersica（Linn）Batsch的干燥成熟种子：红花3结果为菊科植物红花CarthamustinctoriusL的干燥花；3.1保留时间黄芪甲苷：血样经预处理后，在黄地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima芪甲苷色谱条件下进样测定，得血浆色谱图，见图aspergillum（Perrier）的干燥主体。处方黄芪60g，3。大鼠血浆中黄芪甲苷峰在保留时间为15min左当归9g，川芎6g赤芍9g，桃仁9g，红花9g，地龙右可完全分离。药着写川芎嗪：在符药耆、川写嗪9g。Wistar大白鼠，雌雄各半，体重220~300g，由对照品液的色谱条件下测得为药苷、川芎嗪的血浆湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号色谱图。大鼠血浆补阳还五汤中药苷峰在保留时SCXK（湘）2001-2004。间为11.5min左右，川芎嗪峰在保留时间为21.5min左右可完全分离。2.2色谱条件色谱柱UltimateXB-Cis柱（4.6mm×250mm，5μm），黄芪甲苷采用Agi-3.2标准曲线的制备及线性关系的考察分别取试管6只，加入802.1mg·L-黄芪甲苷甲醇溶液lent1200-Alltech3300ELSD测定，流动相乙睛-%对照品液10，25，50，100，200，400μL，水浴蒸干，乙酸溶液（35:65），流速1mLmin-，柱压（15.0±0.408）MPa；温度30℃。芍药苷与川芎嗪采用Agi-再加入空白血浆400μL，经样品预处理后，残渣用50μL甲醇溶解，使血浆中黄芪甲苷的质量浓度分别为lentUV测定，由于两者同时以指纹图谱的形式测定，可在原测定波长的基础上调整为254nm12-3，20.05~802.1mg·L-；另取试管6只，分别加入320.4mg·L为药苷甲醇溶液对照品液1,15,30,60,75，100流动相甲醇-水（33：67），流速1mL·min-，柱压μL，水浴蒸干，再加空白血浆400μL，经样品预处理后，(20.71±0.42）MPa；温度35℃。残渣用50μL甲醇溶解，使血浆中芍药苷的质量浓度2.3给药与取血将补阳还五汤水提醇沉制得的分别为0.801~80.10mg·L-；又取试管6只，分别加复方注射液（分别含黄芪甲苷2.160g·L-，苟药苷入5.140mgL-川芎嗪甲醇溶液对照品液2，5，10，2.578g·L-、川芎嗪25.12mg.L-）。实验大鼠1520，40μL，水浴蒸干，另加入空白血浆400μL，经样尾静脉给药2mL，分别于给药后0.25，0.5，1.25，1.75,2.5,4.5,5.5，8，17.5h，眼眶取血浆400μL，品预处理后，残渣用50证甲醇溶解，使血浆中川弯嗪的质量浓度分别为25.70~514.0μg·L-。在前述色并在1h内进行样品预处理。谱条件下进行测定，以黄芪甲者浓度为纵坐标，黄芪甲2.4样品预处理将补阳还五汤待测血浆400μL苷峰面积为横坐标进行线性回归处理，得回归方程为置手尖底塑料刻度离心管中，加入三氯醋酸液1C=0.18324-0.01,结果表明黄芪甲苷在20~800mgmL，涡旋混合5min，5000r·min-离心10min，取·L-呈良好线性（r=0.9997），黄芪甲苷的最低检测三氯醋酸层，常温下氮气流吹干，残渣用甲醇50μL浓度为0.6mg·L-（S/N>3）：以芍药苷面积为纵坐溶解，取20μL进样。标，药苷浓度为横坐标进行线性回归处理，得回归方2.5空白血浆处理于实验前，取大鼠血样按样品程为A=178.49612C-3.361结果表明荷药昔在处理项下同法制得空白血浆样。0.80~80mg·L-呈良好线性（r=0.9999），芍药苷的2.6对照品液制备精密称取黄芪甲苷对照品最低检测浓度为0.12mg·L-（S/N>3）：以川芎嗪面8.0mg，用甲醇定容至10mL，制得每1mL含黄芪积为纵坐标，川弯嗪浓度为横坐标进行线性回归处理，甲苷0.8mg的对照品液：精密称取芍药苷对照品得回归方程为A=64.70791C+86.32575，结果表明川3.2mg，用甲醇定容至10mL，制得每1mL含芍药芎嗪在25.70~514.0ugL-呈良好线性（r=苷0.32mg的对照品液：精密称取川芎嗪对照品0.9997），川嗪的最低检测质量浓度为8μg·L-15.0mg，用甲醇定容至100mL，再稀释10倍制得每(S/N>3)。1mL含川芎嗪0.005mg的对照品液。3.3精密度和回收率精密度按文献分低、中、高2.7数据处理与分析结果用DAS2.0软处理，分3个浓度进行日内和日间精密度、加样回收率试验别得单个成分、3成分叠加及平均的经典药物动力研究。学参数，按自建的统计矩法分析得药物动力学总量·256·
lactlora Pall 的干燥根茎; 桃仁为蔷薇科植物物桃 Prunus persica ( Linn) Batsch 的干燥成熟种子; 红花 为菊科植物红花 Carthamus tinctorius L. 的干燥花; 地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓 Pheretima aspergillum ( Perrier) 的干燥主体。处方黄芪 60 g， 当归 9 g，川芎 6 g 赤芍 9 g，桃仁 9 g，红花 9 g，地龙 9 g。Wistar 大白鼠，雌雄各半，体重 220 ～ 300 g，由 湖南中医药大学实验动物中心提供，许 可 证 号 SCXK( 湘) 2001-2004。 2. 2 色 谱 条 件 色 谱 柱 Ultimate XB-C18 柱 ( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，黄芪甲苷［11］ 采用 Agilent 1200-Alltech 3300 ELSD 测定，流动相乙腈-1% 乙酸溶液( 35∶ 65) ，流速 1 mL·min － 1 ，柱压( 15. 0 ± 0. 408) MPa; 温度 30 ℃。芍药苷与川芎嗪采用 Agilent UV 测定，由于两者同时以指纹图谱的形式测 定，可在原测定波长的基础上调整为 254 nm［12-13］， 流动相甲醇-水( 33 ∶ 67) ，流速 1 mL·min － 1 ，柱压 ( 20. 71 ± 0. 42) MPa; 温度 35 ℃。 2. 3 给药与取血 将补阳还五汤水提醇沉制得的 复方注射液( 分别含黄芪甲苷2. 160 g·L － 1 ，芍药苷 2. 578 g·L － 1 、川芎嗪 25. 12 mg·L － 1 ) 。实验大鼠 尾静脉给药 2 mL，分别于给药后 0. 25，0. 5，1. 25， 1. 75，2. 5，4. 5，5. 5，8，17. 5 h，眼眶取血浆 400 μL， 并在 1 h 内进行样品预处理。 2. 4 样品预处理 将补阳还五汤待测血浆 400 μL 置于尖底塑料刻度离心管中，加入三氯醋酸液 1 mL，涡旋混合 5 min，5 000 r·min － 1 离心 10 min，取 三氯醋酸层，常温下氮气流吹干，残渣用甲醇 50 μL 溶解，取 20 μL 进样。 2. 5 空白血浆处理 于实验前，取大鼠血样按样品 处理项下同法制得空白血浆样。 2. 6 对照品液制备 精密称取黄芪甲苷对照品 8. 0 mg，用甲醇定容至 10 mL，制得每 1 mL 含黄芪 甲苷 0. 8 mg 的对照品液; 精密称取芍药苷对照品 3. 2 mg，用甲醇定容至 10 mL，制得每 1 mL 含芍药 苷 0. 32 mg 的对照品液; 精密称取川芎嗪对照品 5. 0 mg，用甲醇定容至 100 mL，再稀释 10 倍制得每 1 mL 含川芎嗪 0. 005 mg 的对照品液。 2. 7 数据处理与分析 结果用 DAS 2. 0 软处理，分 别得单个成分、3 成分叠加及平均的经典药物动力 学参数，按自建的统计矩法分析得药物动力学总量 统计矩参数。 3 结果 3. 1 保留时间 黄芪甲苷: 血样经预处理后，在黄 芪甲苷色谱条件下进样测定，得血浆色谱图，见图 3。大鼠血浆中黄芪甲苷峰在保留时间为 15 min 左 右可完全分离。芍药苷与川芎嗪: 在芍药苷、川芎嗪 对照品液的色谱条件下测得芍药苷、川芎嗪的血浆 色谱图。大鼠血浆补阳还五汤中芍药苷峰在保留时 间为 11. 5 min 左右，川芎嗪峰在保留时间为 21. 5 min 左右可完全分离［2］。 3. 2 标准曲线的制备及线性关系的考察 分别取 试管 6 只，加入 802. 1 mg·L － 1 黄芪甲苷甲醇溶液 对照品液 10，25，50，100，200，400 μL，水浴蒸干， 再加入空白血浆 400 μL，经样品预处理后，残渣用 50 μL 甲醇溶解，使血浆中黄芪甲苷的质量浓度分别为 20. 05 ～802. 1 mg·L －1 ; 另取试管 6 只，分别加入 320. 4 mg·L －1 芍药苷甲醇溶液对照品液 1，15，30，60，75，100 μL，水浴蒸干，再加空白血浆400 μL，经样品预处理后， 残渣用50 μL 甲醇溶解，使血浆中芍药苷的质量浓度 分别为0. 801 ～80. 10 mg·L －1 ; 又取试管 6 只，分别加 入5. 140 mg·L －1 川芎嗪甲醇溶液对照品液 2，5，10， 15，20，40 μL，水浴蒸干，另加入空白血浆 400 μL，经样 品预处理后，残渣用50 μL 甲醇溶解，使血浆中川芎嗪 的质量浓度分别为 25. 70 ～ 514. 0 μg·L －1 。在前述色 谱条件下进行测定，以黄芪甲苷浓度为纵坐标，黄芪甲 苷峰面积为横坐标进行线性回归处理，得回归方程为 C =0. 183 2A －0. 01，结果表明黄芪甲苷在 20 ～ 800 mg ·L －1 呈良好线性( r = 0. 999 7) ，黄芪甲苷的最低检测 浓度为 0. 6 mg·L －1 ( S/N ＞ 3) ; 以芍药苷面积为纵坐 标，芍药苷浓度为横坐标进行线性回归处理，得回归方 程为 A = 178. 496 12C － 3. 361，结果表明芍药苷在 0. 80 ～80 mg·L －1 呈良好线性( r =0. 999 9) ，芍药苷的 最低检测浓度为0. 12 mg·L －1 ( S/N ＞3) ; 以川芎嗪面 积为纵坐标，川芎嗪浓度为横坐标进行线性回归处理， 得回归方程为 A =64. 707 91C +86. 325 75，结果表明川 芎 嗪 在 25. 70 ～ 514. 0 μg·L － 1 呈 良 好 线 性 ( r = 0. 999 7) ，川芎嗪的最低检测质量浓度为 8 μg·L － 1 ( S /N ＞ 3) 。 3. 3 精密度和回收率精密度 按文献分低、中、高 3 个浓度进行日内和日间精密度、加样回收率试验 研究。 ·256· 第 38 卷第 2 期 2013 年 1 月 Vol. 38，Issue 2 January，2013
第38卷第2期Vol 38,Issue2中国中药杂志2013年1月January,20130.004.919.814.7414.864.939.860.004.959.9175101251517.52022.5 25275305751012315175202252527530 25 57.5 10 123 15 17.5: 20 225 25 275 3025575101251517.520225252753a黄芪甲苷色谱图（1.黄芪甲苷对照品：2.血浆样品：3.含药血浆样品）：h.芍药苷与川芎嗪色谱图（1.药药苷对照品：2.川嗪对照品：3.含药血浆样品：4.空白血浆样品）。图3补阳还五汤血浆样品中黄芪甲苷、药苷与川芎嗪HPLC图Fig 3HPLC Chromatography of astragaloside IV, paeonflorin and tetramethylpyrazine in Buyang Huanwu injection精密度试验：取大鼠空白血浆400μL，加入黄个浓度的样品，经预处理后分别测定日内精密度和芪甲苷、芍药苷、川芎嗪对照品液，配制低、中、高3日间精密度，结果见表1。表1血浆中黄芪甲苷、药苷、川嗪的精密度测定（n=3)Table1Accuracy of determination of astragaloside V,paeonflorinin, tetramethylpyrazine in plasma (n =3)日内精密度日间精密度加入质量浓度成分/mg -L-t检测量/mg·L-1RSD/%检测量/mg·L-!RSD/%黄芪甲苷40. 1138.1340. 612. 12. 22.72.7401.1397.3403.61.9795.71.6802.1793.72.21.5苟药苔1.6021.5621.6522.940.0540.3839.202.62. 4 80.1078.4079. 392. 90. 025 72. 40. 036 72. 8川芎嗪0. 024 22.50.25700.24870.24552. 32.62.90.514 00.507 80.514 3回收率试验：取空白血浆，加入一定量的黄芪甲实验前夜禁食12h，尾静脉给补阳还五汤注射液2苷、芍药苷、川嗪对照品液，分别配制高、中、低3mL，定时取血与处理，可得药-时曲线，见图4。结果个不同浓度的样品，经预处理后测定，按回归方程计用DAS2.0软处理，分别得单个成分、3个成分叠加算测得量，得到的平均方法回收率列为表2。由表及平均的药物动力学参数，见表3，按自建的统计矩1~2可知，本法能用于3个成分的药物动力学研究法分析得药物动力学总量统计矩参数，见表4。中的浓度测定。3.5补阳还五汤中黄芪甲苷、苟药苷、川芎嗪药物3.4药物动力学测定取大鼠100只，随机分为常规药物动力学及总量统计矩参数计算先用10组，每组10只，每一组为一实验点，一组为空白。DAS软件进行曲线拟合，得表3中常见的药物动力.257
a. 黄芪甲苷色谱图( 1. 黄芪甲苷对照品; 2. 血浆样品; 3. 含药血浆样品) ; b. 芍药苷与川芎嗪色谱图( 1. 芍药苷对照品; 2. 川芎嗪对照品; 3. 含药血浆样品; 4. 空白血浆样品) 。 图 3 补阳还五汤血浆样品中黄芪甲苷、芍药苷与川芎嗪 HPLC 图 Fig. 3 HPLC Chromatography of astragalosideⅣ，paeonflorin and tetramethylpyrazine in Buyang Huanwu injection 精密度试验: 取大鼠空白血浆 400 μL，加入黄 芪甲苷、芍药苷、川芎嗪对照品液，配制低、中、高 3 个浓度的样品，经预处理后分别测定日内精密度和 日间精密度，结果见表 1。 表 1 血浆中黄芪甲苷、芍药苷、川芎嗪的精密度测定( n = 3) Table 1 Accuracy of determination of astragaloside Ⅳ，paeonflorinin，tetramethylpyrazine in plasma ( n = 3) 成分 加入质量浓度 /mg·L － 1 日内精密度 日间精密度 检测量/mg·L － 1 RSD/% 检测量/mg·L － 1 RSD/% 黄芪甲苷 40. 11 40. 61 2. 1 38. 13 2. 2 401. 1 397. 3 2. 7 403. 6 2. 7 802. 1 793. 7 1. 9 795. 7 1. 6 芍药苷 1. 602 1. 562 2. 2 1. 652 1. 5 40. 05 40. 38 2. 9 39. 20 2. 6 80. 10 78. 40 2. 4 79. 39 2. 9 川芎嗪 0. 025 7 0. 024 2 2. 4 0. 036 7 2. 8 0. 257 0 0. 248 7 2. 5 0. 245 5 2. 3 0. 514 0 0. 507 8 2. 6 0. 514 3 2. 9 回收率试验: 取空白血浆，加入一定量的黄芪甲 苷、芍药苷、川芎嗪对照品液，分别配制高、中、低 3 个不同浓度的样品，经预处理后测定，按回归方程计 算测得量，得到的平均方法回收率列为表 2。由表 1 ～ 2 可知，本法能用于 3 个成分的药物动力学研究 中的浓度测定。 3. 4 药物动力学测定 取大鼠 100 只，随机分为 10 组，每组 10 只，每一组为一实验点，一组为空白。 实验前夜禁食 12 h，尾静脉给补阳还五汤注射液 2 mL，定时取血与处理，可得药-时曲线，见图 4。结果 用 DAS 2. 0 软处理，分别得单个成分、3 个成分叠加 及平均的药物动力学参数，见表 3，按自建的统计矩 法分析得药物动力学总量统计矩参数，见表 4。 3. 5 补阳还五汤中黄芪甲苷、芍药苷、川芎嗪药物 常规药物动力学及总量统计矩参数计算 先 用 DAS 软件进行曲线拟合，得表 3 中常见的药物动力 ·257· 第 38 卷第 2 期 2013 年 1 月 Vol. 38，Issue 2 January，2013