大 3、黏粒文库 构建过程与载体构建过程相似：两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的 包装。 ·单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。 为提高文库质量，可采取以下措施： 1.双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2.供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3.载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生 载体DNA Xhol or Sall酶切 补CT 连接 重组 DNA 供体DNA S3AI部分酶切 补AG 17
17 3、黏粒文库 ▪ 构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的 包装。 ▪ 单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。 为提高文库质量，可采取以下措施： 1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生 载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组 DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG
基因组DNA片段3'凹端的不完全补平的策略 AGEM-11 GATC- Sau3AI GATC- -CTAG- CTAG 基因组DNA Klenow dATP/dGTP -GA GATC- -CTAG AG- Vector 互补 CTCGAG- XhoI Klenow -CTC TCGAG- -GAGCTC- -GAGCT CTC. dCTP/dTTP
基因组DNA片段3’凹端的不完全补平的策略 -GATC- -CTAG- - GATC- -CTAG - Sau3AI -GA GATC- -CTAG AGKlenow dATP /dGTP -CTCGAG- -GAGCTCXhoI Klenow dCTP /dTTP -CTC TCGAG- -GAGCT CTC- 互补 GEM-11 基因组DNA Vector
备大 Ap Ori 0r1 HindIII B i 利用单C0质粒载体文库 S1 B 园 BamH I BamH I 天开段 小片段 CoS CoS B H 35-45 kb DNA片段 T4 DNA ligase Cos 离体包装 H
19 Apr Ori cos B H Hind Apr Ori cos B H Cos Hind Apr Ori B H Apr Ori cos B H Cos SalI H S H S Cos S Cos S1 BamH I H S H S Cos S Cos S1 BamH I Cos S1 BamH I H Cos S1 BamH I H Cos H S S H 大片段 小片段 35-45kb DNA 片段 T4 DNA ligase Cos H Cos S ori Ap r 利用单COS 质粒载体文库
AD cOs Smal COS Apr B BamHI 】 OS Apr COS B B 35-45kb供本DNA 构建基因组文库 T4DNA I igase 利用双000质粒载体 C○S Apr COS 离体包装 惑染来E.coL1
20 S 离体包装 S 感染E.coli 利用双COS 质粒载体 构建基因组文库
95 kb DNA fragment PADI0 蜊用P1载体 sacBI 构建基因组文 sacB Kan loxP pAd10sacBⅡ P1 DNA headful Scal+BamHI pac cleavage protein 长臂+短臂 加入外源DNA片段 重组DNA分子 离体包装 感染宿主细胞 冠 Cre DNA Recombi- Amplifi- lation cation
21 sacB BamHI + 95 kb DNA fragment pac loxP sacB Kan DNA headful + + Cre Recombi- lation DNA Amplifi- cation pac cleavage protein loxP Amp Ad10 pAD10 sacBII XbaI (29.3 kb) ScaI pac loxP lyt Rep plasmid Rep kanr r 利用P1载体 构建基因组文库 pAd10 sacBⅡ ScaI+BamHI 长臂 + 短臂 加入外源DNA片段 重组DNA分子 离体包装 感染宿主细胞