华东理工大学 《酶工程》讲义 在的,因此,考虑产物对反应速度的影响,可能具有一定的意义。 第七节不可逆抑制作用 不可逆作用可分为非专一性和专一性两大类。 不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制,最后达到完全抑制。抑制剂 的效应,应以速度常数表示,而不能以平衡常数表示,它决定于给定时间内某一浓度抑制剂 所抑制酶活性分数。 、非专一性的不可逆抑制作用 1.概念:抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。但某些非专一性抑制剂因作用条件 不同,作用对象不同,或由于位阻效应以及活性部位其它基团的存在,也能显示专一性抑制 效应 2.非专一性抑制剂的类型 (1)酰化剂;可用通式表示为RC=0 (2)烃基化剂:R-X表示。如卤烃衍生物,由于卤原子的强电负性,使烃基带部分正电 荷,有利于酶上的一些亲核基团的攻击 (3)含活泼双键的试剂:含活泼双键的试剂,如N-乙基顺丁烯二酰亚胺、丙烯氰等。它 们可与酶分子上的-SH、-NH2等基团起加成反应 (4)亲电试剂:常见的有四硝基甲烷,它可使酶分子上的酪氨酸侧链硝基化。产物具有 特殊光谱性质,易于被检测。 (5)氧化剂:一些二硫化合物可使酶分子上的-SH氧化。如酶分子上的甲硫氨酸的硫醚 基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基等,都可在光敏剂存在下发生温和的光氧化作用,使 酶失活 (6)还原剂:以二硫键为必需基团的酶,可被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失 3.通过非专一性不可逆抑制作用判断酶分子中必需基团的性质和数目 必需测定酶活力降低的反应速度常数和侧链基团被破坏的反应速度常数,比较它们之间 的关系,并加以分析才能作出判断。邹承鲁教授创立了一种方法。他在测定抑制作用过程中 酶活力剩余分数a的同时,又测定酶分子上某必需基团的剩余分数Le。他假定同类基团中 如有n个是必需基团,而且所有这类基团与抑制剂反应活性相等,并且又只有n个必需基团 都未被破坏的酶分子才能保持活性:那么某必需基团的剩余分数Le将会和该类基团总的剩 余分数L相同。根据这些假定他得出:a-Len或a1/n=Le,并且al/m=L,取对数得:lga=nlgL 把lga对lgL作图得一直线,其斜率为n,从而求得该必需基团得数目。该判断酶分子中心 必需基团数目得作图法,已被广泛应用于酶化学修饰的研究。 专一性不可逆抑制剂的类型 1.Ks型专一性不可逆抑制剂 Ks型抑制剂具有与底物相似的可与酶结合的基团,同时还具有一个能与酶其它基团反 应的活泼基团。它之所以有专一性,是由于此抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合 物和它与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。从两个解离常数的 比值,可决定其专一性程度。如果比值在三个数量级以上,则这个不可逆抑制剂是一个专 性很强的抑制剂。判断抑制作用是否发生在酶的活性部位,常用的判断方法如下: (1)如果抑制剂的作用是化学计量的,并且作用后酶活性全部丧失,说明它全部结合在酶 的活性部位 (2)如果底物和竞争性抑制剂能保护酶,使之抵抗不可逆抑制的作用,即可证实此不可 逆抑制剂肯定结合在酶的活性部位, (3)采用简单方法使酶失活,如失活酶不会再与抑制剂反应,则证明该不可逆抑制剂是
华东理工大学 《酶工程》讲义 11 在的，因此，考虑产物对反应速度的影响，可能具有一定的意义。 第七节 不可逆抑制作用 不可逆作用可分为非专一性和专一性两大类。 不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制，最后达到完全抑制。抑制剂 的效应，应以速度常数表示，而不能以平衡常数表示，它决定于给定时间内某一浓度抑制剂 所抑制酶活性分数。 一、非专一性的不可逆抑制作用 ⒈ 概念：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。但某些非专一性抑制剂因作用条件 不同，作用对象不同，或由于位阻效应以及活性部位其它基团的存在，也能显示专一性抑制 效应。 ⒉ 非专一性抑制剂的类型： ⑴ 酰化剂；可用通式表示为 RC=O ⑵ 烃基化剂：R-X 表示。如卤烃衍生物，由于卤原子的强电负性，使烃基带部分正电 荷，有利于酶上的一些亲核基团的攻击。 ⑶ 含活泼双键的试剂：含活泼双键的试剂，如 N-乙基顺丁烯二酰亚胺、丙烯氰等。它 们可与酶分子上的-SH、-NH2等基团起加成反应。 ⑷ 亲电试剂：常见的有四硝基甲烷，它可使酶分子上的酪氨酸侧链硝基化。产物具有 特殊光谱性质，易于被检测。 ⑸ 氧化剂：一些二硫化合物可使酶分子上的-SH 氧化。如酶分子上的甲硫氨酸的硫醚 基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基等，都可在光敏剂存在下发生温和的光氧化作用，使 酶失活。 ⑹ 还原剂：以二硫键为必需基团的酶，可被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失 活。 ⒊ 通过非专一性不可逆抑制作用判断酶分子中必需基团的性质和数目 必需测定酶活力降低的反应速度常数和侧链基团被破坏的反应速度常数，比较它们之间 的关系，并加以分析才能作出判断。邹承鲁教授创立了一种方法。他在测定抑制作用过程中 酶活力剩余分数 a 的同时，又测定酶分子上某必需基团的剩余分数 Le。他假定同类基团中 如有 n 个是必需基团，而且所有这类基团与抑制剂反应活性相等，并且又只有 n 个必需基团 都未被破坏的酶分子才能保持活性；那么某必需基团的剩余分数 Le 将会和该类基团总的剩 余分数 L 相同。根据这些假定他得出： a=Len 或 a1/n=Le，并且 a1/n=L，取对数得：lga=nlgL。 把 lga 对 lgL 作图得一直线，其斜率为 n，从而求得该必需基团得数目。该判断酶分子中心 必需基团数目得作图法，已被广泛应用于酶化学修饰的研究。 二、专一性不可逆抑制剂的类型 ⒈ Ks 型专一性不可逆抑制剂 Ks 型抑制剂具有与底物相似的可与酶结合的基团，同时还具有一个能与酶其它基团反 应的活泼基团。它之所以有专一性，是由于此抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合 物和它与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。从两个解离常数的 比值，可决定其专一性程度。如果比值在三个数量级以上，则这个不可逆抑制剂是一个专一 性很强的抑制剂。判断抑制作用是否发生在酶的活性部位，常用的判断方法如下： ⑴如果抑制剂的作用是化学计量的，并且作用后酶活性全部丧失，说明它全部结合在酶 的活性部位。 ⑵ 如果底物和竞争性抑制剂能保护酶，使之抵抗不可逆抑制的作用，即可证实此不可 逆抑制剂肯定结合在酶的活性部位。 ⑶ 采用简单方法使酶失活，如失活酶不会再与抑制剂反应，则证明该不可逆抑制剂是
华东理工大学 《酶工程》讲义 结合在酶的活性部位。 2.Kcat型不可逆抑制剂(自杀底物) 这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的,它们与底物类似,即能与酶结合,也能被酶 催化发生反应,在其分子中具有潜伏反应基团( latent reactive group),该潜伏反应基团 会被酶催化而活化,并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合,使结合物停留在这种状态, 不能再分解生成产物,酶因而致死,使酶遭受抑制。这种抑制剂专一性很强,又是经酶催化 后引起,所以被称为自杀性底物。 (1)天然酶的自杀底物 在西印度群岛中有一种称为 Ackee Blighia sapida的植物,成熟的果实是牙买加岛居 民的主要食品,但未成熟果实的假种皮却含有一种有毒的降 糖氨酸(即甲叉环丙基丙氨酸)其结构式如右: 此种降糖氨酸的降解产物却是人体中不少重要黄素酶的自杀底物。例如,此物可专一地 抑制异戊酰-CoA脱氢酶,因而导致血中异戊酸的积聚。此种生理异常通过中枢神经系统可 导致剧烈呕吐,称为牙买加呕吐病。通常认为这种致命性疾病的死亡是由于低血糖所引起。 患者血中葡萄糖水平只有0.5mmo1/L,约为正常人的十分之一浓度。 (2)治疗用人工合成的酶自杀底物 治疗高血压:癫痫:抗青霉素的菌株;在肿瘤治疗上:治疗震颠麻痹症;痛风症的自杀 底物疗法。 第八节酶抑制剂的应用 一、医学上的应用 1.青霉素类药物:可以抑制革兰氏阳性 《多捆 A-NAM一NAG 细菌胞壁肽的合成所需要的转肽酶。抗菌素的 问题就是一些菌株产生耐药性。如长期使用青 D-il- NHy 一为上2 D-y 霉素,细菌会诱导出一种适应酶β-内酰胺酶, 可水解青霉素中的内酰胺环,使之成为不杀菌 Dn(ooh) 转盐 先排写素废 的青霉酸酰。(不能形成D丙氨酸-D丙氨酸A-NMN0 .NAG-NAM-NAG- LeI 结构,丧失了杀菌能力) # 对付办法:已合成了几个β-内酰胺酶的 D-ir-NH, D-丙 自杀底物,如:一种青霉素的亚砜衍生物,能 图多6线思款多糖的交联 和抗性细菌的β-内酰胺酶结合使酶自杀,就 可再用青霉素。图如右所示。 两者结构类似,故可竞争性地抑制转肽 -Iooo 票的4其西4-ABA分款多粒的D=一D=酸身 酶,导致胞壁合成障碍 2.中药对酶活性的抑制是近年来又一吸 引人的研究领域。 子巾 二、农业生产上的应用 我的 农业应用面很广,仅杀虫剂农药方面讨 论。农药三大类(有机磷,氨基甲酸酯类,除 虫菊酯类) 农药杀虫的机理一抑制生物体中的靶酶。 多的D丙一D=丙饮酸 例如:有机磷对生物体酶的抑制研究最清 国57茫监和转底物结传的类 楚一靶酶:乙酰胆碱酯酶 有机磷进入人体后在胆碱酯酶的作用下,酶促水解后与E-Ser-OH作用-0-CHE有机磷 的急性毒性,主要归功于对胆碱对神经突触后膜上的乙酰胆碱酶(ACHE)的抑制,造成突触
华东理工大学 《酶工程》讲义 12 结合在酶的活性部位。 ⒉ Kcat 型不可逆抑制剂（自杀底物） 这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，即能与酶结合，也能被酶 催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团(latent reactive group)，该潜伏反应基团 会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合，使结合物停留在这种状态， 不能再分解生成产物，酶因而致死，使酶遭受抑制。这种抑制剂专一性很强，又是经酶催化 后引起，所以被称为自杀性底物。 ⑴ 天然酶的自杀底物 在西印度群岛中有一种称为 Ackee Blighia sapida 的植物，成熟的果实是牙买加岛居 民的主要食品，但未成熟果实的假种皮却含有一种有毒的降 糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）其结构式如右： 此种降糖氨酸的降解产物却是人体中不少重要黄素酶的自杀底物。例如，此物可专一地 抑制异戊酰-CoA 脱氢酶，因而导致血中异戊酸的积聚。此种生理异常通过中枢神经系统可 导致剧烈呕吐，称为牙买加呕吐病。通常认为这种致命性疾病的死亡是由于低血糖所引起。 患者血中葡萄糖水平只有 0.5mmol/L，约为正常人的十分之一浓度。 ⑵ 治疗用人工合成的酶自杀底物 治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀 底物疗法。 第八节 酶抑制剂的应用 一、医学上的应用 ⒈ 青霉素类药物：可以抑制革兰氏阳性 细菌胞壁肽的合成所需要的转肽酶。抗菌素的 问题就是一些菌株产生耐药性。如长期使用青 霉素，细菌会诱导出一种适应酶β-内酰胺酶， 可水解青霉素中的内酰胺环，使之成为不杀菌 的青霉酸酰。（不能形成 D-丙氨酸-D-丙氨酸 结构，丧失了杀菌能力） 对付办法：已合成了几个β-内酰胺酶的 自杀底物，如：一种青霉素的亚砜衍生物，能 和抗性细菌的β-内酰胺酶结合使酶自杀，就 可再用青霉素。图如右所示。 两者结构类似，故可竞争性地抑制转肽 酶，导致胞壁合成障碍。 ⒉ 中药对酶活性的抑制是近年来又一吸 引人的研究领域。 二、农业生产上的应用 农业应用面很广，仅杀虫剂农药方面讨 论。农药三大类（有机磷，氨基甲酸酯类，除 虫菊酯类） 农药杀虫的机理-抑制生物体中的靶酶。 例如：有机磷对生物体酶的抑制研究最清 楚--靶酶：乙酰胆碱酯酶。 有机磷进入人体后在胆碱酯酶的作用下，酶促水解后与 E-Ser-OH 作用--O-CHE 有机磷 的急性毒性，主要归功于对胆碱对神经突触后膜上的乙酰胆碱酶（ACHE）的抑制，造成突触