药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 专家论坛 从精准医学谈药物设计的微观结构 郭宗儒 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,北京100050 摘要:精准医学应用“组学”和系统生物学在分子水平上分析患者的病因,并以靶向治疗手段对患者做个 体化处治。精准医学与药物密切相关。药物作为治疗手段和物质供给侧,在精准医学中主要体现两个方面:针对 特定的靶标或机制进行新药研发;针对疾病的分子特征对患者做个体化治疗的临床应用。基于特定靶标研发新 分子实体是实施精准医疗的前提与保障;而精准医疗的效果和发现的线索又反馈于新药深化研究,二者相互依 存和促进。在精准医学的框架下,新药硏究所涵盖的大都是熟知内容:靶标的发现与确证;靶标与适应证的关联 概念验证,先导物的发现与优化;临床前研究的药效、药代和不良反应与临床试验的关联;药品设计、产业化 和药物经济学的精益化等。从分子水平的视角看,药物的疗效源于药物分子的特定原子或基团与生物大分子的 互补性和在三维空间的相互结合,这些原子基团或片段的严格排布映射了与效应靶标的精确结合。靶标蛋白即 使发生微小的残基改变,也会导致大分子的构象变化,这时药物的分子结构必须做精细的微调以适配变化了的 结构(构象)要求以避免脱靶作用。为了进行个体化治疗,需要根据患者生物标示物的分子特征选择有针对性的 药物,因而需要硏制多种新分子实体。本文列举一些实例试图解析在精准医学时代药物分子设计的某些趋势。 关键词:精准医学;药物设计;概念验证;微观结构;结合动力学 中图分类号:R916 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2017)01-0071-09 On the molecular drug design from viewpoint of precision medicine GUO Zong-ru (Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, ijing 100050, China) Abstract: Precision medicine(PM) involves the application of" omics"analysis and system biology to analyze the cause of disease at the molecular level for targeted treatments of individual patient. Based on the targeted treatment PM is closely related to pharmaceuticals, which, as a therapeutic means and supply front, mainly embody the two aspects: drug discovery/development, and clinical administration. Innovation of new molecular entities with safety and specific efficacy is the prerequisite and guarantee for the PM practice; on the other hand, the outcome and clues in clinical PM feedback to new drug research. PM and drug research/ application are interdependent and promote each other. Aimed at precision medicine, drug discovery and development involve well-known contents: the discovery and validation of targets, the association between target functions and indications(proof of concept), lead discovery and optimization, the association between preclinical investigations and clinical trials, the lean of industrialization and pharmacoeconomics. At the molecular level the therapeutic efficacy originates from the interactive binding between specific atoms or groups of the drug molecule and the complementary atoms or groups of the macromolecular target in three-dimensional space The strict arrangement of such critical atoms, groups, or fragments reflect specific features for a precise binding 收稿日期:2016-08-23;修回日期:2016-09-18 ◆通讯作者Te:86-10-83155752,F- mail: zrguo@ imm.accn DOl:10.16438/05134870.2016-0830
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 · 71 · 从精准医学谈药物设计的微观结构 郭宗儒* (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050) 摘要: 精准医学应用“组学”和系统生物学在分子水平上分析患者的病因, 并以靶向治疗手段对患者做个 体化处治。精准医学与药物密切相关。药物作为治疗手段和物质供给侧, 在精准医学中主要体现两个方面: 针对 特定的靶标或机制进行新药研发; 针对疾病的分子特征对患者做个体化治疗的临床应用。基于特定靶标研发新 分子实体是实施精准医疗的前提与保障; 而精准医疗的效果和发现的线索又反馈于新药深化研究, 二者相互依 存和促进。在精准医学的框架下, 新药研究所涵盖的大都是熟知内容: 靶标的发现与确证; 靶标与适应证的关联 (概念验证); 先导物的发现与优化; 临床前研究的药效、药代和不良反应与临床试验的关联; 药品设计、产业化 和药物经济学的精益化等。从分子水平的视角看, 药物的疗效源于药物分子的特定原子或基团与生物大分子的 互补性和在三维空间的相互结合, 这些原子基团或片段的严格排布映射了与效应靶标的精确结合。靶标蛋白即 使发生微小的残基改变, 也会导致大分子的构象变化, 这时药物的分子结构必须做精细的微调以适配变化了的 结构 (构象) 要求以避免脱靶作用。为了进行个体化治疗, 需要根据患者生物标示物的分子特征选择有针对性的 药物, 因而需要研制多种新分子实体。本文列举一些实例试图解析在精准医学时代药物分子设计的某些趋势。 关键词: 精准医学; 药物设计; 概念验证; 微观结构; 结合动力学 中图分类号: R916 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2017) 01-0071-09 On the molecular drug design from viewpoint of precision medicine GUO Zong-ru* (Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China) Abstract: Precision medicine (PM) involves the application of “omics” analysis and system biology to analyze the cause of disease at the molecular level for targeted treatments of individual patient. Based on the targeted treatment PM is closely related to pharmaceuticals, which, as a therapeutic means and supply front, mainly embody the two aspects: drug discovery/development, and clinical administration. Innovation of new molecular entities with safety and specific efficacy is the prerequisite and guarantee for the PM practice; on the other hand, the outcome and clues in clinical PM feedback to new drug research. PM and drug research/ application are interdependent and promote each other. Aimed at precision medicine, drug discovery and development involve well-known contents: the discovery and validation of targets, the association between target functions and indications (proof of concept), lead discovery and optimization, the association between preclinical investigations and clinical trials, the lean of industrialization and pharmacoeconomics. At the molecular level the therapeutic efficacy originates from the interactive binding between specific atoms or groups of the drug molecule and the complementary atoms or groups of the macromolecular target in three-dimensional space. The strict arrangement of such critical atoms, groups, or fragments reflect specific features for a precise binding 收稿日期: 2016-08-23; 修回日期: 2016-09-18. *通讯作者 Tel: 86-10-83155752, E-mail: zrguo@imm.ac.cn DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-0830 ·专家论坛·
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 to the corresponding target. An alteration of amino acid residues in mutational targets leads to the change in conformation of the target protein, and an accurate structure of drug is necessary for binding to the mutant species and avoiding off-targeting effect. For the tailoring of clinical treatment to the individual patient design and development of various new molecular entities are critical for treatment choice according to the molecular features of biological markers of patients. This article provides some examples and methods of drug design and Key words: precision medicine; drug design; proof of concept; microscopic structure; binding kinetics 1引言 染色体基因变异,“量体裁衣”研制出的。细胞和分 医药科技的发展不断提出新的治疗策略和概念,子生物学研究发现染色体22号与9号的相互易位 近年来出现的精准医学( precision medicine)的概念,导致22号染色体变短,称作费城短染色体,它携带 其核心是通过基因组和蛋白质组学等技术,对于大有Bcr-Abl癌基因,表达的Bcr-Abl融合蛋白,含有功 样本人群与特定疾病类型从分子水平进行分析与鉴能高度激活的酪氨酸激酶,导致细胞内信号转导的 定、验证与应用,从而精确寻找到疾病的原因和治疗失控,引起慢性粒细胞白血病(CML)的发生。CML 的靶标,最终实现对于疾病和特定患者进行个体化具有Abl激酶高表达的遗传特征,作为分子靶标,诺 的精细和准确的治疗。 华成功研制口服治疗CML的药物伊马替尼(1 精准医学与药物密切相关,药物是疾病治疗的 imatinib),经概念验证和临床研究,成为首个治疗 手段和物质保障,在精准医学的框架下体现在两个CML的有效药物,也因此开创了分子靶向药物治疗 方面:一是针对特定的靶标或机制进行新药研发,提的新领域 供安全有效特异和经济的药物;二是临床应用,根据 伊马替尼是通过基于结构的药物设计(SBDD) 患者疾病类型和病情进行个体化的准确治疗。创制安与药物化学构效关系(SAR)而实现结构优化的,研 全有效乃至特效的药物是实现精确治疗的前提与保制过程漫长而曲折,本文不拟作全面介绍,只从晶体 障;按精准原则治疗的结果以及发现的线索或问题结构和结合特征对设计的关键问题加以说明。图la 又反馈于深化新药研究,二者相互依存和促进。 和b分别是伊马替尼与Abl激酶的结合特征和疏水结 笔者不拟使用“精准药学”一语,盖因见仁见合的内环境。其结合要点概述如下:①苯环A的6 智。就新药研发而言,在精准的目标下所涵盖的大都位甲基(又称作旗甲基,fag- methyl)设计的重要性: 是熟知的内容:靶标的发现与确证;靶标与适应证的甲基处于NH-的邻位,邻位基团的阻转效应逼迫嘧 关联(概念验证),先导物的发现与优化,临床前研究啶连同吡啶环发生一定角度的扭转,定向地采取了 的药效、药代和不良反应与临床试验的关联;药品设稳定的构象,将吡啶环“送到”酶的Tyr253残基处, 计、产业化和药物经济学的精益化等等,通过全价值发生ππ结合作用;②连接苯环A与嘧啶环的-NH- 链的实施与监管,提供给精准治疗以安全有效药物。作为氢键给体与酶的重要残基Thr315的侧链羟基 本文拟从药物分子设计的一角,特别是从成功药物与(接受体)形成氢键,Th315是催化中心的门户氨基 靶标结合的微观特征,讨论研发中的一些细节问题。酸,守护和维持催化过程。由于羟基与伊马替尼的 2基于基因差异—伊马替尼的研制 -NH-形成氢键,Thr315失去了门户守卫的作用;③A 治疗慢性粒细胞白血病药物的伊马替尼是基于环4位的连接基-NHCO-将B环及其连接的片段引 Leu354 CH3 I 图1伊马替尼分子(黑色)与Abl激酶的结合特征(a)、与Abl疏水结合示意图(b)
· 72 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 to the corresponding target. An alteration of amino acid residues in mutational targets leads to the change in conformation of the target protein, and an accurate structure of drug is necessary for binding to the mutant species and avoiding off-targeting effect. For the tailoring of clinical treatment to the individual patient design and development of various new molecular entities are critical for treatment choice according to the molecular features of biological markers of patients. This article provides some examples and methods of drug design and development in the new period. Key words: precision medicine; drug design; proof of concept; microscopic structure; binding kinetics 1 引言 医药科技的发展不断提出新的治疗策略和概念, 近年来出现的精准医学 (precision medicine) 的概念, 其核心是通过基因组和蛋白质组学等技术, 对于大 样本人群与特定疾病类型从分子水平进行分析与鉴 定、验证与应用, 从而精确寻找到疾病的原因和治疗 的靶标, 最终实现对于疾病和特定患者进行个体化 的精细和准确的治疗。 精准医学与药物密切相关, 药物是疾病治疗的 手段和物质保障, 在精准医学的框架下体现在两个 方面: 一是针对特定的靶标或机制进行新药研发, 提 供安全有效特异和经济的药物; 二是临床应用, 根据 患者疾病类型和病情进行个体化的准确治疗。创制安 全有效乃至特效的药物是实现精确治疗的前提与保 障; 按精准原则治疗的结果以及发现的线索或问题 又反馈于深化新药研究, 二者相互依存和促进。 笔者不拟使用“精准药学”一语, 盖因见仁见 智。就新药研发而言, 在精准的目标下所涵盖的大都 是熟知的内容: 靶标的发现与确证; 靶标与适应证的 关联 (概念验证); 先导物的发现与优化; 临床前研究 的药效、药代和不良反应与临床试验的关联; 药品设 计、产业化和药物经济学的精益化等等, 通过全价值 链的实施与监管, 提供给精准治疗以安全有效药物。 本文拟从药物分子设计的一角, 特别是从成功药物与 靶标结合的微观特征, 讨论研发中的一些细节问题。 2 基于基因差异——伊马替尼的研制 治疗慢性粒细胞白血病药物的伊马替尼是基于 染色体基因变异, “量体裁衣”研制出的。细胞和分 子生物学研究发现染色体 22 号与 9 号的相互易位, 导致 22 号染色体变短, 称作费城短染色体, 它携带 有 Bcr-Abl 癌基因, 表达的 Bcr-Abl 融合蛋白, 含有功 能高度激活的酪氨酸激酶, 导致细胞内信号转导的 失控, 引起慢性粒细胞白血病 (CML) 的发生。CML 具有 Abl 激酶高表达的遗传特征, 作为分子靶标, 诺 华成功研制口服治疗 CML 的药物伊马替尼 (1, imatinib), 经概念验证和临床研究, 成为首个治疗 CML 的有效药物, 也因此开创了分子靶向药物治疗 的新领域。 伊马替尼是通过基于结构的药物设计 (SBDD) 与药物化学构效关系 (SAR) 而实现结构优化的, 研 制过程漫长而曲折, 本文不拟作全面介绍, 只从晶体 结构和结合特征对设计的关键问题加以说明。图 1a 和 b 分别是伊马替尼与 Abl 激酶的结合特征和疏水结 合的内环境。其结合要点概述如下: ① 苯环 A 的 6 位甲基 (又称作旗甲基, flag-methyl) 设计的重要性: 甲基处于 -NH- 的邻位, 邻位基团的阻转效应逼迫嘧 啶连同吡啶环发生一定角度的扭转, 定向地采取了 稳定的构象, 将吡啶环“送到”酶的 Tyr253 残基处, 发生 π-π 结合作用; ② 连接苯环 A 与嘧啶环的-NH- 作为氢键给体与酶的重要残基 Thr315 的侧链羟基 (接受体) 形成氢键, Thr315 是催化中心的门户氨基 酸, 守护和维持催化过程。由于羟基与伊马替尼的 -NH-形成氢键, Thr315 失去了门户守卫的作用; ③ A 环 4 位的连接基-NH-CO-将 B 环及其连接的片段引 图 1 伊马替尼分子 (黑色) 与 Abl 激酶的结合特征 (a)、与 Abl 疏水结合示意图 (b)
郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 导并插入到酶的裂隙之中,苯环B进入由le293、 Leu298和Leu354构成的疏水腔内,将本来“埋入” 其中的活性环套( A-loop)的DFG挤出,使DFG-in 变成DFG-out构象,而ATP对酪氨酸的磷酸化须为 DFG-in构象。这样,伊马替尼通过影响变构位点阻断 了激酶的催化功能 这些关键性的微观特征保障了伊马替尼分子的 分子形状(构象)从而发生特异性结合山。 CONH-的反向调整 3克服对伊马替尼耐药的帕那替尼 8 2001年上市的伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白 血病的有效药物,长期应用产生耐药性。分子生物学 研究发现,癌细胞为了逃逸伊马替尼的作用,将门户图2帕那替尼与AB晶体结构简图 氨基酸残基( gatekeeper)发生突变,The3l5变异为 Il615,这样,在结构上氨基酸侧链由CH(CH3)OH变 用( enthalpy- entropy compensaton,即焓强熵弱或熵 成CH(CH3CH2CH3,不仅体积变大,空间上阻碍了 强焓弱),但精细的分子设计可以实现焓一熵同向正贡 献,并且使焓贡献最大化,降低仍属正贡献的熵份额, 伊马替尼的进入,而且侧链的羟基缺失,失去与伊马 成为优质药物。疏水性药物与靶标的结合往往是熵因 替尼形成氢键的能力,导致疗效减退。从变异后的结 构特征如何克服耐药性呢? 素占优,结合能大都来源于疏水结合,这种结合的特 ARIAD公司为克服Ab1l变异导致的耐药性, 异性不如焓因素(例如氢键,盐键等)高,而且高疏 水性药物的代谢作用也比较复杂 研发的帕那替尼(2, ponatinib)于2011年上市,帕那 Tibotec公司研制的地瑞那韦(3, darunavit)经 替尼对耐药的激酶和细胞有强效抑制活性(Co分别美国FDA批准于2006年上市,治疗艾滋病。地瑞那 为40和88 nmol.L)。研发者针对Abl11结构变异, 韦是模拟水解反应过渡态的HVⅤ蛋白酶抑制剂,属 关键的设计有两点:①变换了伊马替尼苯环A与嘧 于第二代产品。从化学结构看,地瑞那韦类似于GSK 啶环相连的-NH-基,既然Ab13的门户残基无氢键 公司研制的安普那韦(4, amprenavir),只是在四氢呋 形成能力,而且扩大了空间障碍,就没有必要保留 喃环上又并合了一个四氢呋喃环 NH-片段,而是用乙炔基连接苯环A与杂环。乙炔 基是疏水性的线型小体积连接基,它避开异亮氨酸 侧链的阻挡,使得咪唑并吡啶杂环得以进入疏水腔 中。此处乙炔基为”光秃”的两个p杂化的碳原子 位阻最小,长度适宜。相应的乙烯基或亚乙基化合物 活性降低,提示反式或顺式双键以及柔性的亚乙基 不利于结合,说明精确设计乙炔基之成功。②将A 环的4-胺酰基变为3-酰胺基,位置的变迁和胺酰基 的逆向,增强了氢键的结合力,并且有利于将苯环B 输送入疏水腔中。图2是帕那替尼与Abl13l晶体结 构的简图,标示出乙炔基与异亮氨酸侧链的相对位 置以及酰胺片段的结合特征2。 地瑞那韦与上市前的“那韦”类药物的结构虽 4发掘和利用药物与靶标有利结合的微观特征 然不同,但与HV蛋白酶活性部位的结合模式大同 41提高结合热力学的焓贡献—一第二代HIV蛋白小异,都是蛋白酶底物的过渡态类似物,呈现抑制活 酶抑制剂地瑞那韦药物的活性取决于同靶标的结性的结合力包括疏水作用和氢键结合,以疏水作用 合强度,结合能ΔG越高,活性越强。热力学告诉我为主,因而是熵驱动占优的结合。而地瑞那韦则是以 们,药物与靶标结合的自由能是由焓(△H)与熵焓为主要贡献。表1列出了有代表性的沙奎那韦、替 (-TΔS)构成,虽然焓与熵之间的贡献往往有补偿作拉那韦、安普那韦和地瑞那韦的活性和热力学特征
郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 73 · 导并插入到酶的裂隙之中, 苯环 B 进入由 Ile293、 Leu298 和 Leu354 构成的疏水腔内, 将本来“埋入” 其中的活性环套 (A-loop) 的 DFG 挤出, 使 DFG-in 变成 DFG-out 构象, 而 ATP 对酪氨酸的磷酸化须为 DFG-in 构象。这样, 伊马替尼通过影响变构位点阻断 了激酶的催化功能。 这些关键性的微观特征保障了伊马替尼分子的 分子形状 (构象) 从而发生特异性结合[1]。 3 克服对伊马替尼耐药的帕那替尼 2001 年上市的伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白 血病的有效药物, 长期应用产生耐药性。分子生物学 研究发现, 癌细胞为了逃逸伊马替尼的作用, 将门户 氨基酸残基 (gatekeeper) 发生突变, The315 变异为 Ile315, 这样, 在结构上氨基酸侧链由 CH(CH3)OH 变 成 CH(CH3)CH2CH3, 不仅体积变大, 空间上阻碍了 伊马替尼的进入, 而且侧链的羟基缺失, 失去与伊马 替尼形成氢键的能力, 导致疗效减退。从变异后的结 构特征如何克服耐药性呢？ ARIAD 公司为克服 AblT315I 变异导致的耐药性, 研发的帕那替尼 (2, ponatinib) 于 2011 年上市, 帕那 替尼对耐药的激酶和细胞有强效抑制活性 (IC50 分别 为 40 和 8.8 nmol·L −1 )。研发者针对 AblT315I 结构变异, 关键的设计有两点: ① 变换了伊马替尼苯环 A 与嘧 啶环相连的-NH-基, 既然 AblT315I 的门户残基无氢键 形成能力, 而且扩大了空间障碍, 就没有必要保留 -NH-片段, 而是用乙炔基连接苯环 A 与杂环。乙炔 基是疏水性的线型小体积连接基, 它避开异亮氨酸 侧链的阻挡, 使得咪唑并吡啶杂环得以进入疏水腔 中。此处乙炔基为”光秃”的两个 sp 1 杂化的碳原子, 位阻最小, 长度适宜。相应的乙烯基或亚乙基化合物 活性降低, 提示反式或顺式双键以及柔性的亚乙基 不利于结合, 说明精确设计乙炔基之成功。② 将 A 环的 4-胺酰基变为 3-酰胺基, 位置的变迁和胺酰基 的逆向, 增强了氢键的结合力, 并且有利于将苯环 B 输送入疏水腔中。图 2 是帕那替尼与 AblT315I 晶体结 构的简图, 标示出乙炔基与异亮氨酸侧链的相对位 置以及酰胺片段的结合特征[2]。 4 发掘和利用药物与靶标有利结合的微观特征 4.1 提高结合热力学的焓贡献——第二代 HIV 蛋白 酶抑制剂地瑞那韦 药物的活性取决于同靶标的结 合强度, 结合能 ΔG 越高, 活性越强。热力学告诉我 们, 药物与靶标结合的自由能是由焓 (ΔH) 与熵 (−TΔS) 构成, 虽然焓与熵之间的贡献往往有补偿作 图 2 帕那替尼与 AblT315I晶体结构简图 用 (enthalpy-entropy compensaton, 即焓强熵弱或熵 强焓弱), 但精细的分子设计可以实现焓−熵同向正贡 献, 并且使焓贡献最大化, 降低仍属正贡献的熵份额, 成为优质药物。疏水性药物与靶标的结合往往是熵因 素占优, 结合能大都来源于疏水结合, 这种结合的特 异性不如焓因素 (例如氢键, 盐键等) 高, 而且高疏 水性药物的代谢作用也比较复杂。 Tibotec 公司研制的地瑞那韦 (3, darunavir) 经 美国 FDA 批准于 2006 年上市, 治疗艾滋病。地瑞那 韦是模拟水解反应过渡态的 HIV 蛋白酶抑制剂, 属 于第二代产品。从化学结构看, 地瑞那韦类似于 GSK 公司研制的安普那韦 (4, amprenavir), 只是在四氢呋 喃环上又并合了一个四氢呋喃环。 地瑞那韦与上市前的“那韦”类药物的结构虽 然不同, 但与 HIV 蛋白酶活性部位的结合模式大同 小异, 都是蛋白酶底物的过渡态类似物, 呈现抑制活 性的结合力包括疏水作用和氢键结合, 以疏水作用 为主, 因而是熵驱动占优的结合。而地瑞那韦则是以 焓为主要贡献。表 1 列出了有代表性的沙奎那韦、替 拉那韦、安普那韦和地瑞那韦的活性和热力学特征
74· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 表1地瑞那韦与其他那韦药物的热力学特征 合物取舍的标准,然而,离解常数或IC5o是在封闭的 药物 T△S 平衡状态下测定的热力学特征,是在受试化合物浓 amolL-I /kJ.moll /k -mol-l /.mol-I 沙奎那韦20 度不变的状态下测定的。其实,从深层次上挖掘,还 茚地那韦 0.049 有药物与靶标的结合动力学行为 安普那韦 0.39 55.2 28.8 机体是个开放系统,药物在体内是个动态过程 也瑞那韦0.00 627 53.1 在血浆和细胞中的药物水平处于不断地变化中。在体 内药物与靶标形成复合物,其离解作用不受游离药 表1的数据表明,地瑞那韦的的活性强于既往的 物浓度的影响,复合物的离解速率kr决定了药物占 药物十倍至数百倍。比安普那韦强85倍。更重要的据靶标和与之结合的时程,结合的半衰期(12合,与 是地瑞那韦结合能的焓贡献是熵的5倍,而其他那韦药代的h2不同)越长,在靶标处驻留时间( (residence 多数是熵大于焓,即使安普那韦也只是焓熵持平。地 time,RT)越久,作用时程越长,因而有效剂量低,选 瑞那韦的用药剂量低,有效剂量低是高选择性和低择性高、脱靶性低。用放射性标记测定酶抑制剂的结 脱靶性的表现。此外,地瑞那韦对多种耐药株也有抑 合(ka)与离解速率常数(ktr),非标记方法如用电生 制活性。分析地瑞那韦结构和结合特征,表明与活性 理方法(如膜片钳技术)或表面等离子共振( surface 中心发生了广泛的氢键结合。图3是地瑞那韦与 plasmon resonance,SPR)和核磁共振技术。测定受试 HV蛋白酶复合物晶体结构的简约图,图中的9条虚 物的k与kor值(并由此计算出离解常数Ka值),依 线表示形成的氢键网络结构,将药物分子牢固地结此可分析化学结构与结合动力学关系(SKR)。SKR 合于催化中心。特别是并合的四氢呋喃环,氧原子与 Asp29和Asp30又形成两个氢键,增加的结合能来源 是深层次的SAR,在一定意义上更接近体内的状态 于焓贡献,大大提高了抑酶活性。所以,地瑞那韦是当然,用细胞测定受试物动态物质重分布( dynamic 在结构生物学和分子模拟的指引下,利用了活性中 mass redistribution)或整体动物用正电子发射断层显 心“空余”的氢键给体,在安普那韦的基础上设计 影技术向(PET),所测定的药物结合动力学数据更加 实用。 出有质性飞跃的蛋白酶抑制剂向。 药物分子与靶标的结合速率ko大,离解速率k 小,是由于结合过程伴随构象的变化,尤其是靶标蛋 白构象的改变,提高了离解过程的能垒,复原成游离 状态须越过较高的能垒,以至于km变小,造成“来 之容易去之难”的后果。由于蛋白质的柔性和构象复 杂性,还不能从微观结构预测结合动力学性质,但药 物化学的SKR分析和复合物晶体结构特征,可有助 于理解动力学的某些过程。例如研究周期蛋白依赖性 激酶8周期蛋白C抑制剂,化合物5的侧链增加 图3地瑞那韦与HV蛋白酶复合物的结合模式。虚线代表氢个亚甲基为化合物6,进而变换为叔丁氧羰化合物7, 键结合,圆点为参与复合物生成的结构水 动力学性质乃至热力学的参数都发生显著改变,表2 列出了这些数据 4.2利用结合动力学特征研制高选择性、低脱靶性 表2的数据表明,化合物5~7的骨架结构相同 和长效型药物初始的先导物优化,往往以对靶标影响热力学和动力学变化的主要因素是脲基连接的 的离解常数或ICs0作为活性判断、研究构效关系和化侧链不同。化合物5活性弱,K3500 moll-,h结合 H3CX H2C Y
· 74 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 表 1 地瑞那韦与其他那韦药物的热力学特征 药物 Ki /nmol·L −1 ΔG /kJ·mol−1 ΔH /kJ·mol−1 −TΔS /kJ·mol−1 沙奎那韦 2.0 −53.5 −13.0 −66.5 茚地那韦 0.049 −51.8 −7.6 −59.4 安普那韦 0.39 −55.2 −28.8 −26.4 地瑞那韦 0.0045 −62.7 −53.1 −9.6 表 1 的数据表明, 地瑞那韦的的活性强于既往的 药物十倍至数百倍。比安普那韦强 85 倍。更重要的 是地瑞那韦结合能的焓贡献是熵的 5 倍, 而其他那韦 多数是熵大于焓, 即使安普那韦也只是焓熵持平。地 瑞那韦的用药剂量低, 有效剂量低是高选择性和低 脱靶性的表现。此外, 地瑞那韦对多种耐药株也有抑 制活性。分析地瑞那韦结构和结合特征, 表明与活性 中心发生了广泛的氢键结合[3]。图 3 是地瑞那韦与 HIV 蛋白酶复合物晶体结构的简约图, 图中的 9 条虚 线表示形成的氢键网络结构, 将药物分子牢固地结 合于催化中心。特别是并合的四氢呋喃环, 氧原子与 Asp29'和 Asp30'又形成两个氢键, 增加的结合能来源 于焓贡献, 大大提高了抑酶活性。所以, 地瑞那韦是 在结构生物学和分子模拟的指引下, 利用了活性中 心“空余”的氢键给体, 在安普那韦的基础上设计 出有质性飞跃的蛋白酶抑制剂[4]。 图 3 地瑞那韦与 HIV 蛋白酶复合物的结合模式。虚线代表氢 键结合, 圆点为参与复合物生成的结构水 4.2 利用结合动力学特征研制高选择性、低脱靶性 和长效型药物 初始的先导物优化, 往往以对靶标 的离解常数或 IC50 作为活性判断、研究构效关系和化 合物取舍的标准, 然而, 离解常数或 IC50 是在封闭的 平衡状态下测定的热力学特征, 是在受试化合物浓 度不变的状态下测定的。其实, 从深层次上挖掘, 还 有药物与靶标的结合动力学行为。 机体是个开放系统, 药物在体内是个动态过程, 在血浆和细胞中的药物水平处于不断地变化中。在体 内药物与靶标形成复合物, 其离解作用不受游离药 物浓度的影响, 复合物的离解速率 koff 决定了药物占 据靶标和与之结合的时程, 结合的半衰期 (t1/2 结合, 与 药代的 t1/2不同) 越长, 在靶标处驻留时间 (residence time, RT) 越久, 作用时程越长, 因而有效剂量低, 选 择性高, 脱靶性低。用放射性标记测定酶抑制剂的结 合 (kon) 与离解速率常数 (koff), 非标记方法如用电生 理方法 (如膜片钳技术) 或表面等离子共振 (surface plasmon resonance, SPR) 和核磁共振技术。测定受试 物的 kon 与 koff 值 (并由此计算出离解常数 Kd 值), 依 此可分析化学结构与结合动力学关系 (SKR)。SKR 是深层次的 SAR, 在一定意义上更接近体内的状态。 当然, 用细胞测定受试物动态物质重分布[5] (dynamic mass redistribution) 或整体动物用正电子发射断层显 影技术[6] (PET), 所测定的药物结合动力学数据更加 实用。 药物分子与靶标的结合速率 kon 大, 离解速率 koff 小, 是由于结合过程伴随构象的变化, 尤其是靶标蛋 白构象的改变, 提高了离解过程的能垒, 复原成游离 状态须越过较高的能垒, 以至于 koff 变小, 造成“来 之容易去之难”的后果。由于蛋白质的柔性和构象复 杂性, 还不能从微观结构预测结合动力学性质, 但药 物化学的 SKR 分析和复合物晶体结构特征, 可有助 于理解动力学的某些过程。例如研究周期蛋白依赖性 激酶 8/周期蛋白 C 抑制剂, 化合物 5 的侧链增加两 个亚甲基为化合物 6, 进而变换为叔丁氧羰化合物 7, 动力学性质乃至热力学的参数都发生显著改变, 表 2 列出了这些数据。 表 2 的数据表明, 化合物 5～7 的骨架结构相同, 影响热力学和动力学变化的主要因素是脲基连接的 侧链不同。化合物 5 活性弱, Kd 3 500 nmol·L −1 , t1/2 结合
郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 表2化合物5~7与周期蛋白依赖性激酶8/周期蛋白C的结 H3C.+cH3·Br 合动力学与热力学特征 化合物 Ka/nmol.L-km/s-( mol L-)kor/ s 112 4/min 3500 太快测不出1.0×1 YOH 80 3.7×103 2.9×10 5.7×102 86×10-61400 表3噻托溴铵对毒蕈碱M3和M2受体的离解常数和结合动 只有1.2min,晶体结构表明末端羟基作为氢键给体 力学性质 与活化环套DMG的Met14的羰基形成氢键(图 受体Kd/hmol1-k/s-1·(molL-b)1ks/s 4a)。化合物6的侧链增加了两个亚甲基,结合活性提 3.1×107 3.2×10-4374 高了40多倍,离解速率变慢,t1n结合=40min,晶体学 16×103 基形成氢键(图4b)。化合物7的侧链进一步增长,并M3和M受体的活性参数 以叔丁基为终端,结合作用增强7倍,离解速率很小, 如果只从Kd值分析,由于对M3和M2受体活性 1n2合=1400min,虽然没有形成氢键的羟基,但化合相近,预示着脱靶作用会引起心脏的不良反应。然而 物7在活性中心占据的空间和形状加大(图4c灰色结合动力学的km值相差很大,对M3受体有很长的 部分),活化环套的构象发生显著变化,离解复原成1mDR比M2长10倍,在动力学的层面上体现出选 游离态需要越过较高的能垒,因而7不仅活性强,而择性作用。噻托溴铵作为日服一次的长效喷雾剂,未 且在活性部位的驻留时间也长,预示7的作用时间持显示对心脏的副作用。此外,由于tDR长,即使血 久,选择性高。 药浓度的谷值降到 pmol- mL,仍然维持有舒张气管 另一个实例是治疗慢性阻塞性肺病药物噻托溴作用。分子动力学模拟显示,当噻托溴铵从M3受体 铵(8, tiotropium bromide),于2012年在美国上市。的结合部位解离出去时,要经历如图5a箭头所示的 噻托溴铵是毒蕈碱M3受体阻断剂,可扩张支气管治路径,图中的黑点代表了噻托溴铵的莨菪烷上的C3 疗哮喘和慢阻肺。其实,噻托溴铵对M2受体也有抑原子的踪迹,最终停留在胞外受体的门庭处(虚线圈 制作用,但并未显示出对心脏的不良反应,原因是结附近)若将噻托溴铵放到溶剂中(图5b,分子所处 合动力学提高了选择性作用。表3列出了噻托溴铵对的位置大致与图5a的门庭处相同。用M2受体作动 图4化合物5~7与周期蛋白依赖性激酶8的晶体结构图 过渡态 游离态 时间 时间/ps 噻托溴铵与M3和M2受体结合-离解铡吃过程 图5噻托溴铵与M3受体动力学模拟(a和b)和复合物离解过程的自由能变化图(c)
郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 75 · 表 2 化合物 5～7 与周期蛋白依赖性激酶 8/周期蛋白 C 的结 合动力学与热力学特征 化合物 Kd /nmol·L −1 kon /s−1 ·(mol·L −1 ) −1 koff /s−1 t1/2 结合/min 5 3 500 太快测不出 1.0×10−2 1.2 6 80 3.7×103 2.9×10−4 40 7 10 5.7×102 8.6×10−6 1 400 只有 1.2 min, 晶体结构表明末端羟基作为氢键给体 与活化环套 DMG 的 Met174 的羰基形成氢键 (图 4a)。化合物 6 的侧链增加了两个亚甲基, 结合活性提 高了 40 多倍, 离解速率变慢, t1/2 结合 =40 min, 晶体学 提示侧链呈伸展型构象, 6 的末端 OH 与 Asp98 的羰 基形成氢键 (图 4b)。化合物 7 的侧链进一步增长, 并 以叔丁基为终端, 结合作用增强 7 倍, 离解速率很小, t1/2 结合 =1 400 min, 虽然没有形成氢键的羟基, 但化合 物 7 在活性中心占据的空间和形状加大 (图 4c 灰色 部分), 活化环套的构象发生显著变化, 离解复原成 游离态需要越过较高的能垒, 因而 7 不仅活性强, 而 且在活性部位的驻留时间也长, 预示 7 的作用时间持 久, 选择性高[7]。 另一个实例是治疗慢性阻塞性肺病药物噻托溴 铵 (8, tiotropium bromide), 于 2012 年在美国上市。 噻托溴铵是毒蕈碱 M3 受体阻断剂, 可扩张支气管治 疗哮喘和慢阻肺。其实, 噻托溴铵对 M2 受体也有抑 制作用, 但并未显示出对心脏的不良反应, 原因是结 合动力学提高了选择性作用。表 3 列出了噻托溴铵对 表 3 噻托溴铵对毒蕈碱 M3 和 M2 受体的离解常数和结合动 力学性质 受体 Kd /nmol·L −1 kon /s−1 ·(mol·L −1 ) −1 koff /s−1 t1/2 结合/h M3 0.01 3.1×107 3.2×10−4 37.4 M2 0.02 1.6×108 3.1×10−3 3.5 M3 和 M2 受体的活性参数[8]。 如果只从 Kd 值分析, 由于对 M3 和 M2 受体活性 相近, 预示着脱靶作用会引起心脏的不良反应。然而 结合动力学的 koff 值相差很大, 对 M3 受体有很长的 t1/2(DR), 比 M2 长 10 倍, 在动力学的层面上体现出选 择性作用。噻托溴铵作为日服一次的长效喷雾剂, 未 显示对心脏的副作用。此外, 由于 t1/2(DR)长, 即使血 药浓度的谷值降到 pmol·mL−1 , 仍然维持有舒张气管 作用。分子动力学模拟显示, 当噻托溴铵从 M3 受体 的结合部位解离出去时, 要经历如图 5a 箭头所示的 路径, 图中的黑点代表了噻托溴铵的莨菪烷上的 C3 原子的踪迹, 最终停留在胞外受体的门庭处 (虚线圈 附近); 若将噻托溴铵放到溶剂中 (图 5b), 分子所处 的位置大致与图 5a 的门庭处相同。用 M2 受体作动 图 4 化合物 5～7 与周期蛋白依赖性激酶 8 的晶体结构图 图 5 噻托溴铵与 M3 受体动力学模拟 (a 和 b) 和复合物离解过程的自由能变化图 (c)