8 生物反应工程领域的拓展 教学基本内容： 介绍质粒复制与表达的动力学；超临界相态下的生物反应；菌体形态在发酵 液中的变化；界面微生物生长模型。 8.1 质粒复制与表达的动力学 8.2 超临界相态下的生物反应 8.3 菌体形态在发酵液中的变化 8.4 界面微生物生长模型 授课重点： 1. 质粒复制动力学以及基因表达动力学 2. 菌体形态对传质的影响 3. 界面微生物生长动力学模型 难点： 1. 质粒复制动力学模型的建立 2．界面微生物生长动力学模型的建立 本章主要教学要求： 1. 理解质粒复制动力学以及基因表达动力学。 2. 了解超临界相态下的生物反应 3. 理解菌体形态对传质的影响 4. 了解界面的概念 5. 理解界面微生物生长动力学
8 生物反应工程领域的拓展 教学基本内容： 介绍质粒复制与表达的动力学；超临界相态下的生物反应；菌体形态在发酵 液中的变化；界面微生物生长模型。 8.1 质粒复制与表达的动力学 8.2 超临界相态下的生物反应 8.3 菌体形态在发酵液中的变化 8.4 界面微生物生长模型 授课重点： 1. 质粒复制动力学以及基因表达动力学 2. 菌体形态对传质的影响 3. 界面微生物生长动力学模型 难点： 1. 质粒复制动力学模型的建立 2．界面微生物生长动力学模型的建立 本章主要教学要求： 1. 理解质粒复制动力学以及基因表达动力学。 2. 了解超临界相态下的生物反应 3. 理解菌体形态对传质的影响 4. 了解界面的概念 5. 理解界面微生物生长动力学
8 生物反应工程领域的拓展 1980 年前后，生物工业的核心是微生物发酵工业，此时的生物化学工程领 域更多地开展微生物培养工学方面的研究。由于 1972 年重组 DNA 技术的出现， 1985 年 PCR 技术的开发成功，极大地拓宽了生物反应工程所涉及的的领域。与 此同时。人们对极端条件下微生物活性的变化以及微生物形态变化等方面，给予 了更多的关注。拓宽了生物反应工程领域。 8.1 质粒复制与表达的动力学 利用 DNA 重组技术提高微生物生产有用物质能力已取得可喜的成果。为进行 工程菌株发酵过程中的优化控制，有必要研究目的产物的产率与质粒的基因结 构、基因数量，宿主的遗传特性及发酵过程中操作条件等之间定性与定量的关系。 当基因的表达仅取决于微生物细胞所含基因数量时，工程菌细胞中所含质粒的稳 定性及其复制与表达能力成为至关重要的因素。由于质粒的复制数对于提高工程 菌株的生产能力是重要的决定因素，因此，下面简要介绍质粒复制与表达的动力 学模型。 8.1.1 λdv 质粒的概述 λdv 质粒是从λ噬菌体中分离得到的小突变体，分子量为 4.7×166，约为λ噬 菌体的十分之一。λdv 质粒的“核心区域”由自身控制区域和启始复制区域两 部分构成。前者包括启动子基因、操作子基因、自身阻遇物基因和终止物基因； 后者含有复制起源基因和初始物基因两部分。 质粒复制子的基因结构（Matsebara,Mukai 1975） λdv 基因群是在 PROR的支配下进行表达，I 与 Pr 的复合体 IPr 和活性 ori 的相互结合控制着基因组的复制，而 cro 阻遏蛋白积聚起来会抑制自身操纵子的 转录，最终是作为自身阻遏物而起作用。 8.1.2 动力学模型的几点假设 1、λdv 质粒是由 PRORP 基因构成的一单体形式； 2、由于 I 蛋白质不稳定，其作为限制性初始物而起作用；
8 生物反应工程领域的拓展 1980 年前后，生物工业的核心是微生物发酵工业，此时的生物化学工程领 域更多地开展微生物培养工学方面的研究。由于 1972 年重组 DNA 技术的出现， 1985 年 PCR 技术的开发成功，极大地拓宽了生物反应工程所涉及的的领域。与 此同时。人们对极端条件下微生物活性的变化以及微生物形态变化等方面，给予 了更多的关注。拓宽了生物反应工程领域。 8.1 质粒复制与表达的动力学 利用 DNA 重组技术提高微生物生产有用物质能力已取得可喜的成果。为进行 工程菌株发酵过程中的优化控制，有必要研究目的产物的产率与质粒的基因结 构、基因数量，宿主的遗传特性及发酵过程中操作条件等之间定性与定量的关系。 当基因的表达仅取决于微生物细胞所含基因数量时，工程菌细胞中所含质粒的稳 定性及其复制与表达能力成为至关重要的因素。由于质粒的复制数对于提高工程 菌株的生产能力是重要的决定因素，因此，下面简要介绍质粒复制与表达的动力 学模型。 8.1.1 λdv 质粒的概述 λdv 质粒是从λ噬菌体中分离得到的小突变体，分子量为 4.7×166，约为λ噬 菌体的十分之一。λdv 质粒的“核心区域”由自身控制区域和启始复制区域两 部分构成。前者包括启动子基因、操作子基因、自身阻遇物基因和终止物基因； 后者含有复制起源基因和初始物基因两部分。 质粒复制子的基因结构（Matsebara,Mukai 1975） λdv 基因群是在 PROR的支配下进行表达，I 与 Pr 的复合体 IPr 和活性 ori 的相互结合控制着基因组的复制，而 cro 阻遏蛋白积聚起来会抑制自身操纵子的 转录，最终是作为自身阻遏物而起作用。 8.1.2 动力学模型的几点假设 1、λdv 质粒是由 PRORP 基因构成的一单体形式； 2、由于 I 蛋白质不稳定，其作为限制性初始物而起作用；
3、λdv 质粒是以随机模型的方式进行复制，这已由 DNA 密度沉降实验所证实； 4、复制起源点由于转录作用而活化，初始蛋白与活性化 ori 相结合形成一复合 体，为起始复制，复合体的活性要达到某一临界值； 5、细胞分裂时，质粒以均等方式进行分配； 6、宿主细胞的体积以指数形式增长，质粒对宿主细胞的生长无影响。 8.1.3 质粒复制动力学 λdv 质粒复制动力学方程式见表 8-1。动力学模型是以单细胞为基准，并假定 mRNA 与蛋白质的失活服从一级反应规律。 1. R 的合成 （8-1） （8-2） 2. I 的合成 （8-3） （8-4） 3. ori 的活性化 （8-5） 4. 复制体的形成 （8-6）
3、λdv 质粒是以随机模型的方式进行复制，这已由 DNA 密度沉降实验所证实； 4、复制起源点由于转录作用而活化，初始蛋白与活性化 ori 相结合形成一复合 体，为起始复制，复合体的活性要达到某一临界值； 5、细胞分裂时，质粒以均等方式进行分配； 6、宿主细胞的体积以指数形式增长，质粒对宿主细胞的生长无影响。 8.1.3 质粒复制动力学 λdv 质粒复制动力学方程式见表 8-1。动力学模型是以单细胞为基准，并假定 mRNA 与蛋白质的失活服从一级反应规律。 1. R 的合成 （8-1） （8-2） 2. I 的合成 （8-3） （8-4） 3. ori 的活性化 （8-5） 4. 复制体的形成 （8-6）
式中η称为转录效率。PROR处的转录效率是由 RNA 聚合酶与自身阻遏蛋白 R 相互 作用竞争性与 PROR结合所决定。由于启动子基因和操作子基因重合在一起，因此， R 与 OR1 和 0R2 两者或之一相结合都会抑制启动基因。由统计热力学理论，可求 得转录效率η为 （8-7） 式中， ； 为 R 的总浓度；Kl、 K2和 K3分别为 R 与 OR1、0R2 和 0R3 的结合常数，表示 R 与 OR1、0R2 和 0R3 的亲和 力。 （8-1）和（8-2）式为 R 的合成动力学方程，两方程右边第一项分别为 mRNA 与 R 的生物合成量；第二项分别为 mRNA 与 R 的失活量，第三项为由于宿主的生长 而导致 mRNA 与 R 的变化量。mRNA 与蛋白质在细胞内的浓度以单位体积细胞的摩 尔数来表达，并随细胞的增殖而下降，两者的活力随失活作用而下降。 在某一时刻 t，质粒 DNA 浓度［G］为 （8-8） 式中 G 为每一个细胞内的质粒分子数；V 为时间 t 时的细胞体积；NA为阿伏伽德 罗常数（ ）。 呈指数形式增殖的单一细胞每一世代中的体积变化可由下式来表示。 时, （8-9） 式中 V0为新生细胞的体积；τ为宿主的增倍时间。 在 tR1 处的转录终止效率 f 取值范围为 0 至 1。o 基因的转录速率与η、（1-f） 和 呈比例关系，I 蛋白的生物合成方程式如（8-3）和（8-4）式。 根据上述，通过启始复制领域的转录，使 ori 部位活性化，即由于 o 基因的转录 频率决定了复制起始领域的活性化，形成具有活性的
式中η称为转录效率。PROR处的转录效率是由 RNA 聚合酶与自身阻遏蛋白 R 相互 作用竞争性与 PROR结合所决定。由于启动子基因和操作子基因重合在一起，因此， R 与 OR1 和 0R2 两者或之一相结合都会抑制启动基因。由统计热力学理论，可求 得转录效率η为 （8-7） 式中， ； 为 R 的总浓度；Kl、 K2和 K3分别为 R 与 OR1、0R2 和 0R3 的结合常数，表示 R 与 OR1、0R2 和 0R3 的亲和 力。 （8-1）和（8-2）式为 R 的合成动力学方程，两方程右边第一项分别为 mRNA 与 R 的生物合成量；第二项分别为 mRNA 与 R 的失活量，第三项为由于宿主的生长 而导致 mRNA 与 R 的变化量。mRNA 与蛋白质在细胞内的浓度以单位体积细胞的摩 尔数来表达，并随细胞的增殖而下降，两者的活力随失活作用而下降。 在某一时刻 t，质粒 DNA 浓度［G］为 （8-8） 式中 G 为每一个细胞内的质粒分子数；V 为时间 t 时的细胞体积；NA为阿伏伽德 罗常数（ ）。 呈指数形式增殖的单一细胞每一世代中的体积变化可由下式来表示。 时, （8-9） 式中 V0为新生细胞的体积；τ为宿主的增倍时间。 在 tR1 处的转录终止效率 f 取值范围为 0 至 1。o 基因的转录速率与η、（1-f） 和 呈比例关系，I 蛋白的生物合成方程式如（8-3）和（8-4）式。 根据上述，通过启始复制领域的转录，使 ori 部位活性化，即由于 o 基因的转录 频率决定了复制起始领域的活性化，形成具有活性的
（8-10） 具有活性的 与非活性 的关系为 （8-11） 式中 为 ori 的总浓度。将（8-11）式代入（8-10）式，可得（8-5）式，在 （8-5）式中 （8-12） 由于λdv 质粒是以随机选择模型进行复制,一定时间间隔内,仅有一个质粒进行 复制。因此,由（8-8）式， 可表示为 （8-13） 根据前述，活性复制复合体 REP 的量取决于λdv 质粒起始复制的频率。REP 形成 的模式如下所示。 （8-14） （8-15） 式中：KA为 I 与 Pr 结合的平衡常数； KB为 ori*与 I·Pr 结合的平衡常数。 由 I、Pr 和 ori*的物量衡算 （8-16） （8-17）
（8-10） 具有活性的 与非活性 的关系为 （8-11） 式中 为 ori 的总浓度。将（8-11）式代入（8-10）式，可得（8-5）式，在 （8-5）式中 （8-12） 由于λdv 质粒是以随机选择模型进行复制,一定时间间隔内,仅有一个质粒进行 复制。因此,由（8-8）式， 可表示为 （8-13） 根据前述，活性复制复合体 REP 的量取决于λdv 质粒起始复制的频率。REP 形成 的模式如下所示。 （8-14） （8-15） 式中：KA为 I 与 Pr 结合的平衡常数； KB为 ori*与 I·Pr 结合的平衡常数。 由 I、Pr 和 ori*的物量衡算 （8-16） （8-17）