2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外,某些细胞保留 质粒,但质粒结构发生改变,而不产生外 源蛋白,减少对细胞的有害影响,这就是 结构不稳定性。如果质粒发生突变,仍保 留了抗生素抗性基因,但不合成外源蛋白 那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养 基中生长。而且由于不合成外源蛋白,生 长得比原来的工程菌更快,使得在这种培 养物中带有突变质粒的菌占统治地位,这 种培养情况就是结构不稳定性
2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留 质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外 源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是 结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保 留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白， 那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养 基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生 长得比原来的工程菌更快，使得在这种培 养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这 种培养情况就是结构不稳定性
3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节,结果减少目标 蛋白的合成。例如,控制外源蛋白表达的启 动子,利用宿主细胞的启动子,如果宿主细 胞启动子的改变,将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子, 通过加入乳糖或它的结构类似物(如|PTG) 来启动表达,如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞,从而不能启动细胞的 表达
3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达
4、生长速率占优势的不稳定性 所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体 系统和原宿主载体系统的生长速率不同。如 果变异了的宿主载体系统比原来的宿主载体 系统有生长优势,那么变异了的系统将最终 占优势,基因不稳定性就出现。 (四)表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导,诱因主要 有:温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等
4、生长速率占优势的不稳定性 所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如 果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体 系统有生长优势，那么变异了的系统将最终 占优势，基因不稳定性就出现。 （四）表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等
四、重组大肠杆菌的培养策略 关键点:高密度、高表达 菌密度的测定:光密度(OD值或A值) 在波长600~660nm 菌生长的障碍是 ●重组菌携带外源基因,加重代谢负担,生长 缓慢 ●外源蛋白不能分泌到胞外,在菌体内合成后 就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度 疏水性蛋白对菌体有害,对细胞生长有抑制作 用,甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌 的比生长速率往往远小于宿主菌
四、重组大肠杆菌的培养策略 关键点：高密度、高表达 菌密度的测定：光密度（OD值或A值） 在波长600～660nm 菌生长的障碍是 ⚫重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长 缓慢 ⚫外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后 就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度 疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌 的比生长速率往往远小于宿主菌
高表达的障碍是: ●外源基因的不稳定,造成表达的下降 ●高生长速率与高表达之间的矛盾 ●乙酸的产生 ●蛋白的降解
高表达的障碍是： ⚫外源基因的不稳定，造成表达的下降 ⚫高生长速率与高表达之间的矛盾 ⚫乙酸的产生 ⚫蛋白的降解