些化学合成的乳糖类似物,不受β一半乳糖苷酶的催化分解,却也能与R特异 性结合,使R构象变化,诱导lac操纵元的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷 ( isopropy Thiogalactoside,IPIG就是很强的诱导剂,不被细胞代谢而十分稳定。X gal(5一溴-4一氯一3一吲哚一β一半乳糖苷)地也是一种人工化学合成的半乳糖 苷,可被β一半乳糖苷酶水解产生兰色化合物,因此可以用作β一半乳糖苷酶活 性的指示剂。IPTG和Xga都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。 β一半乳糖苷键 CHOH 图8乳糖,IPTG和 -a-b/ H Xgal的结构 00H HOCH 乳糖 半乳糖苷键 (二CAP的正性调控 CHOH CH CHOH aS-C-H HO 细菌中的cAMP含量oHcB 与葡萄糖的分解代谢 UH亚TG H 有关,当细菌利用葡萄 糖分解供给能量时,cAMP生成少而分解多,cAMP含量低;相反,当环境中无 葡萄糖可供利用时,cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的 cAMP受体蛋白CRP( cAMP receptor protein),当CRP未与cAMP结合时它是没 有活性的,当cAMP浓度升高时,CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而 活化,称为CAP( CRP CAMP activated protein),能以二聚体的方式与特定的DNA 序列结合。 在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段与Plac部分重叠的序列,能与CAP特 异结合,称为CAP结合位点 CaP bind ing site)。CAP与这段序列结合时,可增 强RNA聚合酶的转录活性,使转录提高50倍。相反,当有葡萄糖可供分解利
一些化学合成的乳糖类似物，不受 β－半乳糖苷酶的催化分解，却也能与 R 特异 性结合，使 R 构象变化，诱导 1ac 操纵元的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside, IPTG)就是很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。X －gal(5－溴－4－氯－3－吲哚－β－半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖 苷，可被 β－半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 β－半乳糖苷酶活 性的指示剂。IPTG 和 X gal 都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。 图 8 乳糖，IPTG 和 X gal 的结构 (二)CAP 的正性调控 细菌中的 cAMP 含量 与葡萄糖的分解代谢 有关，当细菌利用葡萄 糖分解供给能量时，cAMP 生成少而分解多，cAMP 含量低；相反，当环境中无 葡萄糖可供利用时，cAMP 含量就升高。细菌中有一种能与 cAMP 特异结合的 cAMP 受体蛋白 CRP(cAMP receptor protein)，当 CRP 未与 cAMP 结合时它是没 有活性的，当 cAMP 浓度升高时，CRP 与 cAMP 结合并发生空间构象的变化而 活化，称为 CAP(CRP cAMP activated protein)，能以二聚体的方式与特定的 DNA 序列结合。 在 1ac 操纵元的启动子 P1ac 上游端有一段与 Plac 部分重叠的序列，能与 CAP 特 异结合，称为 CAP 结合位点(CAP binding site)。CAP 与这段序列结合时，可增 强 RNA 聚合酶的转录活性，使转录提高 50 倍。相反，当有葡萄糖可供分解利
用时,cAMP浓度降低,CRP不能被活化,lac操纵元的结构基因表达下降。 荷萄糖→→→→→降解产物 ATP AMP- 5'AMP CRP CAP 〔非活性状态 (活性状态〕 图9葡萄糖利用对乳糖操纵元的影响 由于Plac是弱启动子,单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放, 还不能使细胞很好利用乳糖,必须同时有CAP来加强转录活性,细菌才能合成 足够的酶来利用乳糖。lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在,又需要没有葡 萄糖可供利用。通过这种机制,细菌优先利用环境中的葡萄糖,只有无葡萄糖而 又有乳糖时,细菌才去充分利用乳糖 细菌对葡萄糖以外的其他糖(如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等)的利用上也有类似 对乳糖利的情况,在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的阿拉伯糖操纵元(ara operon)、半乳糖操纵元( gal operon)中也有CAP结合位点,CAP也起类似的正性 调控作用。所以CAP的通用名称是分解代谢基因激活蛋白 catabolic gene activator 不难看出:CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子,CAP则是对转录 起正性作用的控蛋白棗激活蛋白,编码CRP的基因也是一个调控基因,不过它 并不在1ac操纵元的附近,CAP可以对几个操纵元都起作用。 从上所述,乳糖操纵元属于可诱导操纵π( inducible operon),这类操纵元通常是 关闭的,当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵元使细菌能适应环境的变化 最有效地利用环境能提供的能源底物
用时，cAMP 浓度降低，CRP 不能被活化，1ac 操纵元的结构基因表达下降。 图 9 葡萄糖利用对乳糖操纵元的影响 由于 P1ac 是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使 1ac 操纵元转录开放， 还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有 CAP 来加强转录活性，细菌才能合成 足够的酶来利用乳糖。1ac 操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡 萄糖可供利用。通过这种机制，细菌优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而 又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。 细菌对葡萄糖以外的其他糖(如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等)的利用上也有类似 对乳糖利的情况，在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的阿拉伯糖操纵元(ara operon)、半乳糖操纵元(gal operon)中也有 CAP 结合位点，CAP 也起类似的正性 调控作用。所以 CAP 的通用名称是分解代谢基因激活蛋白(catabolic gene activator protein)。 不难看出：CAP 结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子，CAP 则是对转录 起正性作用的控蛋白棗激活蛋白，编码 CRP 的基因也是一个调控基因，不过它 并不在 1ac 操纵元的附近，CAP 可以对几个操纵元都起作用。 从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元(inducible operon)，这类操纵元通常是 关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵元使细菌能适应环境的变化， 最有效地利用环境能提供的能源底物
四、色氨酸操纵元 色氨酸是构成蛋白质的组分,一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸,细菌要 生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸,但是一旦环境能够提供色氨酸 时,细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸,以减轻自己的负 担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(τ p operon)的调控。 (一)色氨酸操纵元的结构与阻遏蛋白的负性调控 如图10所示,合成色氨酸所需要酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连 排列组成结构基因群,受其上游的启动子Ptp和操纵子o的调控,调控基因tR 的位置远离P-o-结构基因群,在其自身的启动子作用下,以组成性方式低水平表 达分子量为4700的调控蛋白R。R并没有与o结合的活性,当环境能提供足够 浓度的色氨酸时,R与色氨酸结合后构象变化而活化,就能够与o特异性亲和结 合,阻遏结构基因的转录,因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵元 ( repressible operon),即这操纵元通常是开放转录的,当有效应物(色氨酸为阻遏 剂)作用时,则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵元都属于这种类型, 其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态 P o upL 辅阻蛋白 6000 6000 45000 X0000 00 f链 二聚体 四聚体 吲噪甘油 邻氨基荣甲酸合成酶 磷酸合成色氮酸合凤酬 oMC OOOH COH CHCOOOH CHOP OHOH CHCHCHOP 图10色氨酸操纵元的结构和调控示意图 (二)衰减子及其作用
四、色氨酸操纵元 色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要 生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸 时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负 担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(trp operon)的调控。 (一)色氨酸操纵元的结构与阻遏蛋白的负性调控 如图 10 所示，合成色氨酸所需要酶类的基因 E、D、C、B、A 等头尾相接串连 排列组成结构基因群，受其上游的启动子 Ptrp 和操纵子 o 的调控，调控基因 trpR 的位置远离 P-o-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表 达分子量为 47000 的调控蛋白 R。R 并没有与 o 结合的活性，当环境能提供足够 浓度的色氨酸时，R 与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与 o 特异性亲和结 合，阻遏结构基因的转录，因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵元 (repressible operon)，即这操纵元通常是开放转录的，当有效应物(色氨酸为阻遏 剂)作用时，则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵元都属于这种类型， 其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态。 图 10 色氨酸操纵元的结构和调控示意图 (二)衰减子及其作用
实验观察表明:当色氨酸达到一定浓度,但还没有髙到能够活化R使其起阻遏 作用的程度时,产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低,而且产生的酶量与色氨 酸浓度呈负相关。仔细硏究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。 前导 MKAIFVLKGwwRTS核蛋白体 衰减子结构 mRNA UUUU3 C DNA Tp密碍子 前导肽 p结构基因 图11色氨酸操纵元中的衰减子结构及其调控示意图 在色氨酸操纵元Ptp-o与第一个结构基因tpE之间有162bp的一段先导序列 lead ingsequence,L)实验证明当色氨酸达一定浓度时,RNA聚合酶的转录会终止 在这里。这段序列中含有编码由14个氨基酸组成的短肽的开放读框,其序列中 有2个色氨酸相连,在此开放读框前有核糖体识别结合位点(RBS)序列,提示这 段短开放读框在转录后是能被翻译的。在先导序列的后半段含有3对反向重复序 列(图19?1中A、B及C),在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构,但 由于B的序列分别与A和C重叠,所以如果B形成发夹结构,A和C都不能再 形成发夹结构;相反,当A形成发夹结构时,B就不能形成发夹结构,却有利 于C生成发夹结构。C后面紧跟一串A(转录成RNA就是一串U),C实际上是
实验观察表明：当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化 R 使其起阻遏 作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨 酸浓度呈负相关。仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。 图 11 色氨酸操纵元中的衰减子结构及其调控示意图 在色氨酸操纵元 Ptrp-o 与第一个结构基因 trpE 之间有 162bp 的一段先导序列 (leadingsequence, L)实验证明当色氨酸达一定浓度时，RNA 聚合酶的转录会终止 在这里。这段序列中含有编码由 14 个氨基酸组成的短肽的开放读框，其序列中 有 2 个色氨酸相连，在此开放读框前有核糖体识别结合位点(RBS)序列，提示这 段短开放读框在转录后是能被翻译的。在先导序列的后半段含有 3 对反向重复序 列(图 19?1 中 A、B 及 C)，在被转录生成 mRNA 时都能够形成发夹式结构，但 由于 B 的序列分别与 A 和 C 重叠，所以如果 B 形成发夹结构，A 和 C 都不能再 形成发夹结构；相反，当 A 形成发夹结构时，B 就不能形成发夹结构，却有利 于 C 生成发夹结构。C 后面紧跟一串 A(转录成 RNA 就是一串 U)，C 实际上是
一个终止子,如果转录mRNA时它形成发夹结构,就能使RNA聚合酶停止转录 而从mRNA上脱离下来。 图12三种不同情况 Excess Trp T'rp-Starved 下A、B、C形成发夹 结构的状态 在色氨酸未达到能起 Termination naton Termination 阻遏作用的浓度时, 从Ptp起始转录, RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA,同时核糖体就结合到新生成的mRNA核 糖体结合位点上开始翻译。当色氨酸浓度低时,生成的 tRNAtrp色氨酸量就少, 能扩散到核糖体mRNA形成的翻译复合体中供给合成短肽的几率低,使核糖体 沿mRNA翻译移动的速度慢,赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度,这 时核糖体占据短开放读框的机会较多,使A不能生成发夹结构,于是B就形成 发夹结构,阻止了C生成终止信号的结构,RNA聚合酶得以沿DNA前进,继 续去转录其后trpE等基因,tp操纵元就处于开放状态。当色氨酸浓度增高时, tRNAtrp色氨酸浓度随之升高,核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快,占据到 B段的机会增加,B生成发夹结构的机会减少,C形成终止结构的机会增多,RNA 聚合酶终止转录的的几率增加,于是转录减弱。如果当其他氨基酸短缺(注意: 短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有 的氨基酸都不足时,核糖体翻译移动的速度就更慢,甚至不能占据A的序列 结果有利于A和C发夹结构的形成,于是RNA聚合酶停止转录,等于告诉细菌: 整个氨基酸都不足,即使合成色氨酸也不能合成蛋白质,不如不合成以节省能 量 由此可见,先导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作用,这段序列就称为衰 减子 attenuator))。在卬p操纵元中,对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗 调的作用,而衰减子起到细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如 组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子 存在
一个终止子，如果转录 mRNA 时它形成发夹结构，就能使 RNA 聚合酶停止转录 而从 mRNA 上脱离下来。 图 12 三种不同情况 下 A、B、C 形成发夹 结构的状态 在色氨酸未达到能起 阻遏作用的浓度时， 从 Ptrp 起始转录， RNA 聚合酶沿 DNA 转录合成 mRNA，同时核糖体就结合到新生成的 mRNA 核 糖体结合位点上开始翻译。当色氨酸浓度低时，生成的 tRNAtrp 色氨酸量就少， 能扩散到核糖体 mRNA 形成的翻译复合体中供给合成短肽的几率低，使核糖体 沿 mRNA 翻译移动的速度慢，赶不上 RNA 聚合酶沿 DNA 移动转录的速度，这 时核糖体占据短开放读框的机会较多，使 A 不能生成发夹结构，于是 B 就形成 发夹结构，阻止了 C 生成终止信号的结构，RNA 聚合酶得以沿 DNA 前进，继 续去转录其后 trpE 等基因，trp 操纵元就处于开放状态。当色氨酸浓度增高时， tRNAtrp 色氨酸浓度随之升高，核糖体沿 mRNA 翻译移动的速度加快，占据到 B 段的机会增加，B 生成发夹结构的机会减少，C 形成终止结构的机会增多，RNA 聚合酶终止转录的的几率增加，于是转录减弱。如果当其他氨基酸短缺(注意： 短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有 的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据 A 的序列， 结果有利于 A 和 C 发夹结构的形成，于是 RNA 聚合酶停止转录，等于告诉细菌： “整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能 量 ”。 由此可见，先导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作用，这段序列就称为衰 减子 attenuator)。在 trp 操纵元中，对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗 调的作用，而衰减子起到细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如 组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子 存在