细胞生物学教程 http://www.cella.cn 标DNA以指数级数增长，经大约20一30次循环后，扩增产物中主要是目标DNA。 第三节细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基 本手段。一般认为，转速为1025 Kr/min的离心机称为高速离心机：转速超过 25 Kr/min,离心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达 100 Kr/min,.离心力超过500Kg。 (一)、差速离心(differential centrifugation) 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞 器（图2-22）。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、 内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降 颗粒裹到沉淀块出 般重复23次效果 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞 更多用于分离细胞器。通过差速离心可 将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 图2-22速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 (二)、密度梯度离心(density gradient centrifugation) 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀 浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 卧为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图223。密度梯度离心常用的个质为氯华 铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1)能产生密度梯度，且密度高时
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 29 标 DNA 以指数级数增长，经大约 20—30 次循环后，扩增产物中主要是目标 DNA。 第三节 细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基 本手段。一般认为，转速为 10~25Kr/min 的离心机称为高速离心机；转速超过 25Kr/min，离心力大于 89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达 100Kr/min，离心力超过 500Kg。 （一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞 器（图 2-22）。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、 内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降 颗粒裹到沉淀块中，一般重复 2～3 次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可 将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 图 2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀 浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可 分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图 2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化 铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 粘度不高：2)PH中性或易调为中性；3)浓度大时渗透压不大：4)对细胞无毒。 -sample ng 图2-23A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞 或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物 颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不 同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 到与肉樱布外质处并停留在罪里达到平，限需将不同度的源深 等密度沉降(isO 梯度的 质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮 到与自 胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分 的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需 要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间 也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心 名
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 30 粘度不高；2）PH 中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 图 2-23 A 等速度沉降，B 等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞 或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物 颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不 同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮 到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细 胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分 的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需 要的力场通常比速率沉降法大 10~100 倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间 也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。 因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 二、流式细胞术 艺试细爬术是对弹个细胞进行快宽定爸分析与分选的一门木源感过 过程中， 包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包 液滴， 在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号， 送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分 离纯度可达99%（图2-24）。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计 (flow cytometer)。 Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser FALS Sensor Fluorescence detecto Charged Plates 图2-24用流式细胞计分选细胞 三、细胞电泳 在一定P州值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳 动，这种现象称为细胞电泳(cell electrophoresis)。☑引起细胞电泳的电位值称为ξ 电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场 中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可 通过测定电泳速 来推算 出细 5电危 细胞生理状态和病理状 异，因此在诊断疾病上有一定价值。此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 31 力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。 因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 二、流式细胞术 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选 过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴， 在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号， 送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分 离纯度可达 99%（图 2-24）。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计 （flow cytometer）。 图 2-24 用流式细胞计分选细胞 三、细胞电泳 在一定 PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳 动，这种现象称为细胞电泳（cell electrophoresis）。引起细胞电泳的电位值称为 ξ 电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场 中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可 通过测定电泳速度来推算出细胞的 ξ 电位。ξ 电位常因细胞生理状态和病理状态而 异，因此在诊断疾病上有一定价值。此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度
细胞生物学教程 http:/www.cella.cn 不同，细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分 开。 第四节细胞培养与细胞杂交 一、细胞培养 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞 在体内(invo)的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外(nvo) 培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存 活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就 要死亡。所以细胞培养技术(cell culture)就是选用最佳生存条件对活细胞进行璃 养和研究的技术。 动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。 (一)、动物细胞培养 细胞培养方式大致可分为两种（图2-25）：一种是群体培养(mass culture) 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长 形成均匀的单细胞层： 汇合(conflu 另一种是克隆培养（© 将高度稀释的游离细 胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每 一个细跑 形成一个细胞集落，称为克隆(clone)。 个细胞克隆中的所有细胞均来源于同 个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养 瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。 图2-25群体培养（左）和克隆培养（右）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 32 不同，细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分 开。 第四节 细胞培养与细胞杂交 一、细胞培养 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞 在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in vitro） 培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存 活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就 要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培 养和研究的技术。 动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。 （一）、动物细胞培养 细胞培养方式大致可分为两种（图 2-25）：一种是群体培养（mass culture）， 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence） 后形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细 胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞 形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一 个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养 瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。 图 2-25 群体培养（左）和克隆培养（右）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 表23目前实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 Hela 宫颈癌上皮细胞 BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 上皮细胞 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 奖细响 小鼠 SP2/0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。 所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世 界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta 1aks的阳女身上取下的宫细胞璃养而成。细胞系一直证用至今 1. 原代培养 (primary c lture):从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养 代数 -般10代以内) 停止生长 要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代 培养(Passage)。 2.细胞株(cell strain):从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞 群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 3.细胞系(cell line):从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转 化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 4.克隆(clone):亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同 个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 (二)、植物细胞培养 植物细响培养主要右加下几种技术， 1. 诱发产年 伤组织 2-26)，如果条件适宜，可培养出再生植株 用于研究 直物的生长发育 分化和 进行无性繁殖 悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合 2. 进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 3.原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体(protoplast),其特点是：① 比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA:②便于进行细胞融合，形成杂交细胞： ③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株： 4.单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完 全纯合的个体。 33
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 33 表 2-3 目前实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 人 BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。 所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世 界上许多实验室所广泛传用的 HeLa 细胞系就是 1951 年从一位名叫 Henrietta Lacks 的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。 1． 原代培养 （primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养 的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般 10 代以内）停止生长，需 要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代 培养（Passage）。 2． 细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞 群，能够繁殖 50 代左右，在培养过程中其特征始终保持。 3． 细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转 化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 4． 克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一 个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 （二）、植物细胞培养 植物细胞培养主要有如下几种技术： 1． 组织培养：诱发产生愈伤组织（图 2-26），如果条件适宜，可培养出再生植株。 用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。 2． 悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于 进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 3． 原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast），其特点是：① 比较容易摄取外来的遗传物质，如 DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株： 4． 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完 全纯合的个体