细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-19人类血细胞SEM照片 图片来自htp:lw.denniskunkel.coml (三)、扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜( e,STM)由Binnig等1981 年发明，根据量 子力学原理中的隧道效 米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压(2mV~2V),针尖与样品之 间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有 函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探 针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种 改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向 为0.1-0.2nm,纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均 可进行观察 而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 原子牌霜通物路高接新坚药被大命A和玉蛋白质等分千的 利用扫描 道显 三、显微操作技术 显微操作技术(micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下，利 用显微操作器( ,图220)进行细胞或早期胚胎操作的 种方法 显微操作器是用 微镜视野内移动的机械装置 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切 割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，G0rdon等人(1962)对非洲爪蟾进行 核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 24 图 2-19 人类血细胞 SEM 照片 图片来自 http://www.denniskunkel.com/ （三）、扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由 Binnig 等 1981 年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳 米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之 间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有 函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探 针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种 改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向 为 0.1~0.2nm，纵向可达 0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均 可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如 DNA、RNA 和蛋白质等分子的 原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。 三、显微操作技术 显微操作技术（micromanipulation technique）是指在高倍复式显微镜下，利 用显微操作器（micromanipulator，图 2-20）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切 割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon 等人（1962）对非洲爪蟾进行 核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 并取得了丰硕成果。 图2-20尼康NT-88NE显微操作注射仪（图片来自ttp://www.nikon.com 第二节生物化学与分子生物学技术 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的 没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。 一、细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色(histochemical or cytochemical staining)是利用染 色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究 (一)、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有 :如血磨 或直 妾冷冻切
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 25 并取得了丰硕成果。 图 2-20 尼康 NT-88NE 显微操作/注射仪 （图片来自 http://www.nikon.com） 第二节 生物化学与分子生物学技术 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的， 没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。 一、细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染 色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究 的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白 质、糖类、脂类、核酸、酶等。 （一）、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有： 1． 物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。 2． 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活 性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选 择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙 明缓冲液固定。 (二)、显示方法 1.金属沉淀法：利用金屈化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的 物质或酶活性。如磷酸酶分解碱酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS 有色沉淀，而显示出酶活性。 2.偶氯偶联法：酚类化合物与偶氯染料结合后可以形成耐晒染料 3. 式剂 无色品红变为红色。这种反应通 4.联苯胺反应：过氧化氢酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化 成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6.Formazane反应：显示脱氢酶。 7.“Nad"反应：显示细朐角素氧化路 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 二、免疫细胞化学 免疫细胞化学(immunocytochemistry)是根据免疫学原理，利用抗体同特定 抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合 的小分子：抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的y球蛋白。如果将抗体结合上 标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组 织中的部位， 常用的标记物有荧光素和酶 荧光素标记的称为免疫荧光法 (immunofluorescent technique)常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、罗丹明(rhodamine)等。酶标记的称为酶标免疫法 (enzyme-labeled antibody method),常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase),酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部 抗休与抗原的结合方法可可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的 作 休上与抗原后成 在的部位
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 26 和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活 性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选 择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙 酮缓冲液固定。 （二）、显示方法 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的 物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成 CoS 或 PbS 有色沉淀，而显示出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通 常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。 4. 联苯胺反应：过氧化氢酶分解 H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化 成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane 反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质。 二、免疫细胞化学 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定 抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合 的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的 γ 球蛋白。如果将抗体结合上 标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组 织中的部位。 常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法 （immunofluorescent technique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate ）、 罗 丹 明 （ rhodamine ）等。酶标记的称为酶标免疫法 （enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部 位。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗 体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础 上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 三、显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等 都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260m,而蛋白质的则为 280m。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分 所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量 测定。 四、放射自显影术 放射自显影术(:auoradiography),用于研究标记化合物在机 体、组 和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等 其原理是将放射性同位素（如1“℃和3H)标记的化合物导入生物体内，经过一段时 间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织 中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即 可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这 样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 这种技术与由锫样品外理， 则为电镜放射自显影 由于有机大分 含有碳、 般常选用“℃和3H标记。“℃ 和3H均为弱放射性同位素，半衰期长， 为5730年，H为12.5年。 一般常用 H胸腺嘧啶脱氧核苷(HTDR)米显示DNA,用3H尿嘧啶核苷(HUDR)显示 RNA:用3H氨基酸研究蛋白质，研究多糖则用3H甘露糖、3H岩藻糖等。 五、分子杂交技术 分子杂交技术(mole ular hybn ization)是在研究DNA分子复性变化基础上 发展起来的一种技 其原理是，具有 补核苷酸序列的丽 于片段 在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的 双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 (一)、原位杂交(in situ hybridization)。 用来检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，通过 放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造， 深针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置（图2-21）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 27 三、显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等 都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为 260nm，而蛋白质的则为 280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分 所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量 测定。 四、放射自显影术 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机 体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 其原理是将放射性同位素（如 14C 和 3 H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时 间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织 中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即 可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这 样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影。 由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用 14C 和 3 H 标记。14C 和 3 H 均为弱放射性同位素，半衰期长，14C 为 5730 年，3 H 为 12.5 年。一般常用 3 H 胸腺嘧啶脱氧核苷（3 H-TDR）来显示 DNA，用 3 H 尿嘧啶核苷（3 H-UDR）显示 RNA；用 3 H 氨基酸研究蛋白质，研究多糖则用 3 H 甘露糖、3 H 岩藻糖等。 五、分子杂交技术 分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究 DNA 分子复性变化基础上 发展起来的一种技术。其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段， 在适当条件下，通过氢键结合，形成 DNA-DNA，DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂交的 双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）、原位杂交（in situ hybridization）。 用来检测染色体上的特殊 DNA 序列。最初是使用带放射性的 DNA 探针，通过 放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造， 探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置（图 2-21）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-21人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片（米自htp:MwwM.orml.go) (二)、Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒 体DNA切成D 凝胶电泳分 离后， 转移到醋 纤 海膜上 再用标记的 探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 六、PCR技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)用于在体外将微量的目 标DNA大量扩增，以便进行分析。 反应体系：①样品DNA:②引物(primer),是人工合成的一对寡核苷酸链（约 15-20个核苷酸)，用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域：③4种 dNTP;④Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌(Thermus aquaticus)中分离出 来的。此酶最适作用温度为75~80℃，但短时间在95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体 系和适量的Mg2。 反应过程：①变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95℃）使DNA 双链解离：②复性：降温（约60℃左右）退火，使引物与模板结合：③延伸：升温 度至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段： ④重复上述“变性 延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链DNA 较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的 28
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 28 图 2-21 人类染色体端粒 DNA 的荧光原位杂交照片(来自 http://www.ornl.gov) （二）、Southern 杂交 是体外分析特异 DNA 序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核 DNA 或线粒 体 DNA 切成 DNA 片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的 探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 六、PCR 技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于在体外将微量的目 标 DNA 大量扩增，以便进行分析。 反应体系：①样品 DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约 15-20 个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板 DNA 互补区之间的区域；③4 种 dNTP；④Tag DNA 聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出 来的。此酶最适作用温度为 75~80℃，但短时间在 95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体 系和适量的 Mg2+。 反应过程：①变性：将反应液置于 PCR 仪中，提高温度（约 90-95℃）使 DNA 双链解离；②复性：降温（约 60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温 度至 70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成 DNA 双链片段； ④重复上述“变性——复性——延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链 DNA 较多，但随着反应的进行，长链 DNA 以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目