细胞生物学教程 http://www.cella.cn 进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发 展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合 方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、D1C、摄影装置于一体，从而操作灵活， 使用方便。 二、电子显微镜 (一)、透射电子显微镜 1、基本原理 在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微结构 (submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures ultrastructures)。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜 的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电 子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前 TEM的分辨力可达0.2nm 与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用 用 电破场作透镜。另的 由于电子束的穿透力很弱 ,因此 电镜 石的超博切片。 这种 切片需要用超湾切片机 (ultramicrotome)制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明 系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 表2-2不同光源的波长 名称可见光紫外光X射线射线 电子束 波长(nm)390-760133900.05130.00510.1230.0122 2、制样技术 1)超薄切片 诿常以饿酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的 品切片（图2-13），切片厚度20~50nm,切片采用重金属盐染色，以增大反 19
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 19 进入 20 世纪 80 年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发 展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合 方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活， 使用方便。 二、电子显微镜 （一）、透射电子显微镜 1、基本原理 在光学显微镜下无法看清小于 0.2µm 的细微结构，这些结构称为亚显微结构 （ submicroscopic structures ）或超微结构（ ultramicroscopic structures ； ultrastructures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜 的分辨率。1932 年 Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电 子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前 TEM 的分辨力可达 0.2nm。 电子显微镜（图 2-12）与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用 电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜 的标本须制成厚度约 50nm 左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机 （ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明 系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等 5 部分构成。 表 2-2 不同光源的波长 电子束 名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线 0.1Kv 10Kv 波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122 2、制样技术 1）超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式 推进样品切片（图 2-13），切片厚度 20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反 差（图 2-14）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-12JEM-1011透射电子显微 LEICA ULTRACUT )莱卡超薄切片机 20
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 20 图 2-12 JEM-1011 透射电子显微镜 图 2-13 莱卡超薄切片机
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-14内质网透射电镜图（伪彩色 2)负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染 色：吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没 有染料沉积，从而出现负染效果（图2-15），分辨力可达1.5m左右。 Barbed end 图2-15肌动蛋白纤维的负染电镜照片
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 21 图 2-14 内质网透射电镜图（伪彩色） 2）负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染 色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没 有染料沉积，从而出现负染效果（图 2-15），分辨力可达 1.5nm 左右。 图 2-15 肌动蛋白纤维的负染电镜照片
细胞生物学教 http://www.cella.cn 3)冰冻蚀刻 冰冻蚀刻(freeze-etching)亦称冰冻断裂(freeze-fracture)。标本置于-100'C 的干冰或-196℃的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在 真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻(etching)。蚀刻后，向断面以 45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯 把碳和铂的膜剥下米，此膜即为复膜(T©pica)复膜显 标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构《图 2-16)。 图2-16冰冻蚀刻电镜照片 (二)、扫描电子显微镜 扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM,图2-17、18、19) 于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电 子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关， 也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变 为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度， 是示出与电 束同步的扫描图像。图像 林形象，日 了标本的表面绘 使标本 表面发射出次级 已子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金厨微.为 金屈在电子束的轰击下发出次级电子信号
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 22 3）冰冻蚀刻 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100˚C 的干冰或-196˚C 的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在 真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以 45 度角喷涂一层蒸汽铂，再以 90 度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯 酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了 标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构（图 2-16）。 图 2-16 冰冻蚀刻电镜照片 （二）、扫描电子显微镜 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，图 2-17、18、19） 于 20 世纪 60 年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电 子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关， 也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变 为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度， 显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了 使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重 金属在电子束的轰击下发出次级电子信号
细胞生物学教 http://www.cella.cn 目前扫描电镜的分辨力为6~10nm,人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的 光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 图2-17JE0L扫描电子显微镜 light source objective le时 图2-18光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 23 目前扫描电镜的分辨力为 6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距 0.2mm 的 光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为 0.2mm/10nm=20000X。 图 2-17 JEOL 扫描电子显微镜 图 2-18 光学显微镜、TEM、SEM 成像原理比较