细胞生物学教程 http://www.cella.cn (三)、激光共聚焦扫描显微境 图2-5激光共聚焦扫描显微镜 图26CSM照片，蓝色为细跑核，绿色为微管，图片来自tp://wwwitg.uiue,ed 激光作扫 逐点 逐行、逐面快速扫描成像 大 微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时， 就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机 14
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 14 （三）、激光共聚焦扫描显微境 图 2-5 激光共聚焦扫描显微镜 图 2-6 LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管，图片来自 http://www.itg.uiuc.edu 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope，图 2-5、6）用 激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一 个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波 长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显 微镜的 3 倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时， 就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分 的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 (四)、暗视野显微镜 暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片，使照 明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背 景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子， 分辨率可比普通显微镜高50倍】 Objectivelens Stage Condenser Light Dark-field stop 图2-7暗视野照明方式 (五)、相差显微镜 mic ,图2-8、9)由P.Zernike于1932 染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提 高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射， 偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少114入，则光程 差变为12入，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 15 分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分 的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 （四）、暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope，图 2-7）的聚光镜中央有当光片，使照 明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背 景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm 的微粒子， 分辨率可比普通显微镜高 50 倍。 图 2-7 暗视野照明方式 （五）、相差显微镜 相差显微镜（phasecontrast microscope，图 2-8、9）由 P．Zernike 于 1932 年发明，并因此获 1953 年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经 染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提 高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射， 偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4λ（波长），如果再增加或减少 1/4λ，则光程 差变为 1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1.环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光 器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光 或衍射光的相位推迟14入。分为两种： 1.A*相板：将直射光推迟14A,两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本 结构比周围介质更加变亮，形成京反差（或称负反差) 2.B相板： 将衍射光推迟 1/4 两组光线合轴后光波相减。振幅变小，形成 暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 Phase Contrast Light Pathways Figure 1 图2-8相差显微镜照明原理 图2-9一种介壳虫的染色体(PCM照片) 16
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 16 差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1. 环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光 器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2. 相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光 或衍射光的相位推迟 1/4λ。分为两种： 1. A+ 相板：将直射光推迟 1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本 结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2. B+ 相板：将衍射光推迟 1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成 暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 图 2-8 相差显微镜照明原理 图 2-9 一种介壳虫的染色体（PCM 照片）
细胞生物学教 http://www.cella.cn (六)、偏光显微镜 偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝 纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器） 使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的 起偏器)，这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无 论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折 射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种 物体。 (七)、微分干涉差显微镜 1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜 arki contrast r contrast pe 示结构的 与相差显微镜相比，其标本可略厚 点，折射率差别更大， 故影像的立体感更强 DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DC利 用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行 器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。 在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即D1C棱镜，此棱镜可将一束光分解成 偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微 镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后， 由王标水的 度和折射率 ”两市发生了业 竞的后焦面处安装了第二个 Nol aston DIC 滑行器 它把两束 束 这时两束光的价 振面 (x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜 DC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具 有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。×和y波的光程差决定着透光的多 少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达 到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到 最佳状态，可酒过调节DC滑行婴的纵行激调来改变业程常.业程差可可改恋影像的 亮度。 调节DC滑行器可使标本的细微结构现出正或负的投影形象，通常是一侧 闲)潮盐明可生面子海杀‘绍封不形三华丫阳4型面冠·知一各望鉴
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 17 （六）、偏光显微镜 偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、 纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器）， 使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的 起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无 论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折 射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种 物体。 （七）、微分干涉差显微镜 1952 年，Nomarski 在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜 （differential interference contrast microscope）。DIC 显微镜又称 Nomarski 相差 显微镜（Nomarki contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC 显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC 利 用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC 棱镜、DIC 滑行 器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。 在聚光器中则安装了石英 Wollaston 棱镜，即 DIC 棱镜，此棱镜可将一束光分解成 偏振方向不同的两束光（x 和 y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微 镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的 厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个 Wollaston 棱镜，即 DIC 滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面 （x 和 y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜 DIC 影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具 有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x 和 y 波的光程差决定着透光的多 少。光程差值为 0 时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达 到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到 最佳状态，可通过调节 DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的 亮度。调节 DIC 滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧 亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕（图 2-10）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-10D1C显微镜下的硅藻（伪彩色） D1C显微镜使细胞的结构，特别是 些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体 感特别 于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在 (八)、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后 者在载物台之上（图2-11），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 图211菜卡倒置显微镜 18
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 18 图 2-10 DIC 显微镜下的硅藻（伪彩色） DIC 显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体 感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在 这种显微镜下进行。 （八）、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后 者在载物台之上（图 2-11），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 图 2-11 莱卡倒置显微镜