DNA重组与细胞转化及重组 DNA的提取和酶切鉴定 实验组员:王晨辰,王嘐嘐,宋杨 指导老师:潘鸾凤,王松梅 实验时间:2012.09.14.2012.0921 实验目的 学习DNA克隆技术和细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义,掌握氯化钙制备大 肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌并筛选转化的方法;学习和掌握质粒的快速 提取纯化、限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳等方法和技术。 实验原理 DNA重组与细胞转化 将用EcoR和Ca出来的14 kb c-myc DNA片段在T4DNA连接酶的作用下,连接入同样 经EcOR和Ca切开的pBR322质粒载体上,以 E coli HB101菌株为受体细胞,用CaC处 理受体菌使其处于感受态,然后与pBR322质粒共保温,实现转化。pBR322质粒谢带有抗 氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性,用Amp表 示。将经过转化后的受体细胞在含氨苄青霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存 活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 重组质粒的提取及酶切鉴定 因质粒在细胞内具有高拷贝数,本实验用小量制备法抽提质粒DNA即可获得足量DNA用于 基因操作。本实验采用碱变性法抽提质粒,其原理是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与 复性的差异而达到分离目的。在pH高达126的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,染 色体DNA的氢键断裂,双螺旋解构变性,而质粒DNA超螺旋共价闭合环状的两条互补链不 会完全分离,用pH4.8NaAc高盐缓冲液重新调节pH至中性时,质粒DNA复性,而染色体 DNA不能复性,通过离心,与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来 而被除去。分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤:(1)培养细菌使质粒扩增;(2)收 集和裂解细菌;(3)分离和纯化质粒DNA。十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁裂解, 细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
液中。用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。将经限制性内切酶EXOR|和cla酶切的质粒 DNA进行琼脂糖凝胶电泳,将出现两条区带:43 kb pBr322质粒载体片段和14 kb c-myc 目的基因片段。 实验器材和试剂 器材 恒温摇床,电热恒温箱培养箱,无菌操作超净台,恒温振荡器,电热恒温水浴,台式离心 机,低温高速离心机,漩涡振荡器,电泳槽及电泳仪,紫外观察仪,移液枪和枪头,细 菌培养管,15 ml Eppendorf管,15m离心管,冰浴,接种环,长玻璃试管,滴管,刻度 吸管等。 试剂 用EcoR|和cal处理的pBR322线状DNA(20ng/仙;用EcoR|和cal处理的14 kb c-myc DNA片段(20ng/u);T4DNA连接酶(0Uu);10×连接酶缓冲液;6×凝胶加样缓冲 液;已经装有cmyc目的片断的pBR322质粒DNA(5ng/u);LB培养基;含琼脂的LB培 养基;0.1 mol/L CaC|2;氨苄青霉素储存液;提取重组质粒DMA试剂盒(包含LB培养基, Buffer s1, Buffer S2, Buffer S3, RNase A, 1xTAE: BufferW1, BufferW2 Eluent);10xmui- core buffer; EcoR I;cal;乙酰化BSA; gelLed; Agarose等。 实验步骤 DNA重组与细胞转化 DNA片段连接 1)向1.5 ml Eppendorf管中加入连接反应物如下 14kb目的基因片段(20ng/)2.5μ 4.3kb载体DNA(20ng小p)25 10x连接 Buffer dd h20 3.5 T4DNA连接酶 05μl 总体积 10 2)混匀并短暂离,置于16°水浴中温育2小时 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
2.制备感受态细胞 1)用移液枪移取0.1m大肠杆菌菌液,加入已装有5mlLB培养液的玻璃试管中。于37℃C 温箱中振摇培养2小时,直至内眼呈云雾状。 2)在酒精灯旁将该5m细菌培养物倒入冰预冷的15m离心管中,冰浴10min。 3)4000m下冷离心10mn 4)酒精灯旁弃去离心管上清,并于纸巾上控干剩余液体。用1m0.1 mol/L CaC|2重悬沉 淀,吹打均匀,移入15 ml Eppendorf管中,冰浴10min 5)4000rpm下冷离心10mn 6)再次于酒精灯旁弃去管内上清,并于纸巾上控干剩余液体。用200p0.1 mol/L CaC2重 悬沉淀,吹打均匀,使细菌处于感受态。 7)分别分装50感受态细菌于两只新 Append管中,分别标记为“转化和+”(阳性对 照),立即转化。 3.转化 1)在酒精灯旁分别向两管中加入1连接产物质粒DNA和已知阳性对照质粒DNA。冰浴 30min。 2)42℃水浴中热休克90s,迅速取出。 3)在无菌条件下分别加人LB培养液150μ,盖好管盖,37℃振摇45min使其复苏 4)在酒精灯旁分别从两管中取100u菌液,分别于含AmpC(60pg/m)的LB平板上涂板 (分别标记为“转化”和+"),令其均匀分布,放入37℃温箱中倒置2小时,待液体充分收 干后改为平放,继续在37C下培养过夜 重组DNA的提取和酶切鉴定 1.重组质粒的小量快速制备 1)在50m离心试管中加入10m含60 uIml Amp的LB培养液,从重组质粒转化细菌涂布的 平板上挑取一个单菌落接种于其中,37℃温箱中震荡培养过夜。 2)取 Eppendo一只,向其中倒入15m菌液,12000×g离心1min,弃去上清,并于纸巾 上控干液体 3)重新向 Eppendor中倒入15m菌液,再次12000×g离心1mn,弃上清,纸巾上控干液 体 晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
4)加入250u已含 RNase A的 Buffer s1,轻轻用加样枪吹打、悬浮细菌沉淀,直至均 5)加入250μ Buffer s2,立即盖好 Eppendorf盖,轻轻将其上下颠倒10次,见菌液逐渐变 清 6)迅速加入350μ I Buffer S3,盖好管盖,温和并充分地上下翻转混合8次,12000xg离心 10min。 7)将移液枪旋至800μ,小心吸取离心后上清,转移至2m离心管中的制备管中 12000Xg离心1min,弃去滤液。 8)将制备管放回离心管,加入500 Buffer w1,12000Xg离心1min,弃去滤液。 9)将制备管放回离心管,加入700 Buffer w2,120009离心1min,弃去滤液。 10)用700 Buffer w2重复洗涤1次,12000xg离心min,弃去滤液。 11)将制备管放回离心管,12000Xg空离心1min 12)取出制备管,移入新的15m的离心管中,向制备管膜中央加入65℃水浴预热 Eluent 液体40,静置1min,12000g离心1min,弃去制备管。 2.质粒DNA的限制性内切酶双酶切鉴定 1)酶切 取一只15 ml Eppendor管,标记为酶切”,向其中加入酶切反应物如下 10xmulti-core buffer 2 ul EcoR I(16u/Hl) Cla I(10 u/uD dd H20 6山l 质粒DNA溶液 10叫 总体积 20 ul 混匀后短暂离心,37℃水浴1小时。 2)电泳 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
a.配制40m1% Agrose溶液:称取 Agrose049,放入250m烧瓶中,加入40m1xTAE溶 液,置微波炉中大火加热1mn左右,沸腾后打开炉门,轻轻摇晃瓶身,待气泡消失后重新 加热5s,再次沸腾后摇晃瓶身,重复3次,至溶解均匀完全。 b.放置电泳板于水平桌面上,插上梳子。待 Agrose溶液冷却至50℃C左右时,加入EB溶液 (10mg/m)2μl,摇晃瓶身使之混匀,立即浇板,水平桌面上静置待凝。 C.胶凝后轻轻拔去梳子,放入电泳槽,向槽中加入1xTAE至浸没凝胶。 d.上样:依次按如下样品混匀,向上样孔内加样并标记为AB,C A孔:5μ Marker(0.1pg/u)+1p6 lOading Buffer B孔:10叫抽提出的pBR322重组质粒DNA含14 kb c-myc基因)+2pl6× Loading uffer C孔:20μ酶切产物+4pl6 LOading Buffer; e,电泳:盖上电泳槽盖,接通电源,加样孔位于负极,在5Vcm电压下电泳,待溴酚蓝跑 到凝胶12处停止电泳。 f.紫外灯下观察结果并拍照留档 实验结果 DNA重组与细胞转化(Fig1Fig2) 培养基内转化组(Fig1)和阳性对照组(Fig2)均有菌落生长,转化组培养基上的菌落数量 明显多于阳性对照组。转化组的菌落数约为250个,而阳性对照组培养基上生长的菌落数 约为20个。转化组的菌落生长分布较均匀密集,而阳性对照组的菌落分布零散。说明实验 成功,目的基因连接到载体形成重组质粒,转化体大肠杆菌由于携带抗Amp的基因,能在 选择性培养基Amp抗性平板生长,实现了转化体的筛选。 重组质粒的提取及酶切鉴定(Fig3Fig.4) 重组质粒DNA(含14kbc-myc基因)(B)电泳后表现为一条条带,位于约35kb处;酶切 产物(C)电泳后表现为两条条带,位置上大致与43kb和14kb相符合,前者应为质粒载 体片段,后者应为目的基因片段。图中可见两组条带的边缘均带毛刺和阴影,其他样孔 是另外两个实验组的结果,可见最左边实验组较我组结果,条带更加清晰,边缘更加平 整。造成该现象的原因将在讨论中进行分析。 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250