《细胞生物学》教案（第3次课2学时）第二章细胞生物学研究方法(Chapter 3. Techniques in Cell Biology）[教学要求]2.1知识目标1.对细胞生物学的研究手段和方法进行初步了解，对不同的研究方法和手段在细胞生物学研究中的应用有初步的认识；2.掌握光学显微镜的成像原理；3.通过实验课了解和掌握光学显微镜各部分的结构和功能，，并学习正确使用光学显微镜的方法及维护常识。2.2能力目标1.通过实际操作掌握普通光学显微镜的使用；2.通过实际操作掌握荧光显微镜的使用。2.3德育目标1.要研究一个细胞生物学的问题，首先要从全局给出一个基本的程序，引导学生考虑问题要细致、全面、严谨：2.整个过程需要查阅文献，分析总结，利用适合的仪器、技术等，才能得出可靠的实验数据，引导学生意识到查阅文献的重要性，各种技术学习的重要性。[教学重点]仪器方法的基本原理和基本应用[教学难点]电镜制样及分子杂交技术[教学时数] 2学时[主要内容]第二节细胞及其组分的分析方法[参考资料]翟中和。细胞生物学，第五版．北京：高等教育出版社，2020[教学内容]
《细胞生物学》教案 （第 3 次课 2 学时） 第二章细胞生物学研究方法 （Chapter 3. Techniques in Cell Biology） [教学要求] 2.1 知识目标 1. 对细胞生物学的研究手段和方法进行初步了解，对不同的研究方法和手段在细胞生物学 研究中的应用有初步的认识； 2. 掌握光学显微镜的成像原理； 3. 通过实验课了解和掌握光学显微镜各部分的结构和功能,，并学习正确使用光学显微镜的 方法及维护常识。 2.2 能力目标 1. 通过实际操作掌握普通光学显微镜的使用； 2. 通过实际操作掌握荧光显微镜的使用。 2.3 德育目标 1. 要研究一个细胞生物学的问题，首先要从全局给出一个基本的程序，引导学生考虑问题 要细致、全面、严谨； 2. 整个过程需要查阅文献，分析总结，利用适合的仪器、技术等，才能得出可靠的实验数 据，引导学生意识到查阅文献的重要性，各种技术学习的重要性。 [教学重点] 仪器方法的基本原理和基本应用 [教学难点] 电镜制样及分子杂交技术 [教学时数] 2 学时 [主要内容] 第二节 细胞及其组分的分析方法 [参考资料] 翟中和． 细胞生物学， 第五版．北京：高等教育出版社，2020． [教学内容]
一个细胞能不能被拆散，然后通过多重的分离，分析方法，来研究构成细胞的那些组分，这些组分包括各种细胞器，大的复合物（例如：蛋白质和核酸形成的核糖体：细胞中蛋白质转运过程当中设计的一些膜泡：细胞里的两类关键的生物大分子，蛋白质和核酸）。通过胞内组分的分析方法研究细胞分子水平上的一些基础性问题。第二节细胞组分的分析方法细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物原理：利用颗粒大小的不同：差速离心法；速度区带离心法；利用颗粒密度的不同：等密度离心法用途：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机：转速超过25000r/min，离心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。沉降系数（sedimentationcoefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/の2r。s是沉降系数，の是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降速度表示，（thevelocityperunitforce）并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒.沉降系数越大在离心时候越先沉降。如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。差速离心（Differencialcentrifugation）：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器，根据颗粒沉降速度不同得以分离。01000 g20 000g8000g1150 000g10min20min1h3h细胞核细胞勺浆线粒体、溶酶体、微体、高尔基体、核糖体、大分子复合物过氧化物酶体囊泡或病毒用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分
一个细胞能不能被拆散，然后通过多重的分离，分析方法，来研究构成细胞的那些组分，这些 组分包括各种细胞器，大的复合物（例如：蛋白质和核酸形成的核糖体； 细胞中蛋白质转运过程当 中设计的一些膜泡； 细胞里的两类关键的生物大分子，蛋白质和核酸）。通过胞内组分的分析方法 研究细胞分子水平上的一些基础性问题。 第二节 细胞组分的分析方法 细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。 一、 用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 原理：利用颗粒大小的不同：差速离心法；速度区带离心法；利用颗粒密度的不同：等密 度离心法 用途：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分 子基本手段。一般认为，转速为 10000-25000r/min 的离心机称为高速离心机；转速超过 25000r/min，离心力大于 89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达 80000r/min，离心力超过 500Kg。 沉 降系数（sedimentation coefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于 每单位离心场的速度。或 s=v/ω2r。s 是沉降系数，ω 是离心转子的角速度（弧度/ 秒），r 是到旋转中心的距离，v 是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降速度表 示，（the velocity per unit force）并且通常为 1～200×10-13 秒范围，10-13 这个因 子叫做沉降单位 S，即 1S=10-13 秒.沉降系数越大在离心时候越先沉降。如血红蛋 白的沉降系数约为 4×10-13 秒或 4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在 4S 和 40S 之间，核糖体及其亚基在 30S 和 80S 之间，多核糖体在 100S 以上。 差速离心（Differencial centrifugation）： 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器，根 据颗粒沉降速度不同得以分离。 用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分
OCOEEDCINUEEC速度区带离心法：用于分离大小差别不显著的组分：（用蔗糖梯度液稳定沉淀的成分，防止对流的混合）样品离心e慢沉降组分燕糖密快沉降组分度梯度密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化，蔗糖和多聚蔗糖。用于精细组分或生物大分子的分离。利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示（沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的沉降速率）。等密度离心法：按细胞组分的浮力不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了DNA的不保留复制
速度区带离心法：用于分离大小差别不显著的组分；（用蔗糖梯度液稳定沉淀的成分，防 止对流的混合） 密度梯度离心： 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置 于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度 沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 用于精细组分或生物大分子的分离。 利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即 利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。 细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数 S 来表 示(沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的 沉降速率)。 等密度离心法：按细胞组分的浮力不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度 不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相 等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了 DNA 的不保留复制
NNAA格养手台R培子正二代AMDAE谢定代宝商性化装G图车保银型制的低养层析：1、纸层析（用滤纸；水的移动速度比乙醇大；）2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作用被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。常用方法：离子交换层析；凝胶过滤层析；亲和层析；
层析：1、纸层析 （用滤纸；水的移动速度比乙醇大；） 2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作 用被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。 常用方法：离子交换层析；凝胶过滤层析；亲和层析；
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。1.金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS（硫化钻）或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3.Schif反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。4.联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。6.Formazane反应：显示脱氢酶。7.Nadi"反应：显示细胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。9.萌三酮反应：显示蛋白质。原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。福尔根（Feulgen）反应可特异显示DNA的存在部位。PAS（高碘酸-希夫反应）反应可确定多糖的存在。四氧化钱可证明脂肪滴的存在。苏丹II和苏丹黑也常用于脂肪的鉴定。米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。三、特异蛋白质抗原的定位与定性免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。1、免疫荧光技术免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限直接免疫荧光标记技术：利用偶联荧光分子的抗体与细胞或细胞切片进行孵育，使抗体和相应抗原结合，在荧光显微镜下对抗原进行定位的技术。间接免疫荧光标记技术：即不带荧光标记的第一抗体与相应抗原孵育形成复合物后，再用荧光标记的第二抗体识别第一抗体，从而显示抗原所在位置
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法 原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在 细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或 酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成 CoS（硫化钴）或 PbS 有色沉 淀，而显示出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于 显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。 4. 联苯胺反应：过氧化酶分解 H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺 蓝，进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane 反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质。 原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染 色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。 福尔根(Feulgen)反应可特异显示 DNA 的存在部位。 PAS（高碘酸-希夫反应）反应可确定多糖的存在。 四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 Ⅲ和苏丹 黑也常用于脂肪的鉴定。 米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。 检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使 产物显示出来 。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。 三、特异蛋白质抗原的定位与定性 免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。 1、免疫荧光技术 免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术 相结合研究特异蛋白质抗原在细 胞内分布的方法。根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素， 对抗原进行定位测定的技术。 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 直接免疫荧光标记技术：利用偶联荧光分子的抗体与细胞或细胞切片进行孵育，使抗体 和相应抗原结合，在荧光显微镜下对抗原进行定位的技术。 间接免疫荧光标记技术：即不带荧光标记的第一抗体与相应抗原孵育形成复合物后，再 用荧光标记的第二抗体识别第一抗体，从而显示抗原所在位置