·16·病原生物学与免疫学实验一一综合创新篇米巴和费第虫经铁苏木素染色后，虫体皇蓝黑色：经碘液染色后，虫体呈黄色或浅棕黄色。隐抱子虫经改良抗酸染色后，卵囊皇玫瑰红色。【注意事项】1.标本采集采集的粪便要新鲜，容器要清洁避免与化学药物或尿混合。挑取适量的粪便，尽量选取有黏液或脓血的部分。最好采集急性期、抗生素使用前的粪便标本，防止病原体死亡。肛周检查最好在早晨排便前进行。2.培养，肠道内存在大量的正常菌群，一般分离可疑致病菌应使用选择性平板。沙门菌、志贺菌的选择性增菌培养基能抑制革兰阳性细菌及暂时性抑制大肠埃希菌和变形杆菌类细菌，并促成沙门菌和志贺菌生长。寄生虫标本的培养应严格控制幼虫孵化的温度。3.检测规范实验操作，根据环境温度延长或缩短标本处理的时间；观察标本时注意光线的调节：多次检查可以提高阳性率。附：肠道内正常菌群和粪便标本中常见病原体，见表1-3-3。表1-3-3肠道内正常菌群和粪便标本中常见病原体正常菌群常见病原体革兰阳性细菌葡萄球菌、粪链球菌、双歧杆金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、庆氧链球菌、结核分枝杆菌、乳杆菌、产气荚膜梭菌等菌、破伤风梭菌等革兰阴性细菌大肠埃希菌、产气杆菌、变形致病性大肠埃希菌、志贺菌、伤寒沙门菌、其他沙门氏杆菌、铜绿假单胞菌、类杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌等军、弯曲菌等其他白假丝酵母菌溶组织内阿米巴、贾第虫、隐孢子虫、肝吸虫、肺吸虫、姜片虫、日本血吸虫、猪带综虫和牛带絲虫、钩虫、蝴虫、鞭虫等【实验报告】1.记录本次实验的生化反应结果并解释。2.记录肥达试验的结果并分析讨论。3.以伤寒沙门菌引起的肠热症为例，设计检测实验流程，写出具体的操作步骤，并对实验结果进行分析与讨论。4.描述醛醚沉淀法的实验步骤，记录镜下观察到的寄生虫卵，并绘制其形态。（李小翠刘转转）
·16· 病原生物学与免疫学实验——综合创新篇 米巴和贾第虫经铁苏木素染色后，虫体呈蓝黑色；经碘液染色后，虫体呈黄色或 浅棕黄色。隐孢子虫经改良抗酸染色后，卵囊呈玫瑰红色。 【注意事项】 1. 标本采集 采集的粪便要新鲜，容器要清洁，避免与化学药物或尿混 合。挑取适量的粪便，尽量选取有黏液或脓血的部分。最好采集急性期、抗生素 使用前的粪便标本，防止病原体死亡。肛周检查最好在早晨排便前进行。 2. 培养 肠道内存在大量的正常菌群，一般分离可疑致病菌应使用选择性 平板。沙门菌、志贺菌的选择性增菌培养基能抑制革兰阳性细菌及暂时性抑制大 肠埃希菌和变形杆菌类细菌，并促成沙门菌和志贺菌生长。寄生虫标本的培养应 严格控制幼虫孵化的温度。 3. 检测 规范实验操作，根据环境温度延长或缩短标本处理的时间；观察 标本时注意光线的调节；多次检查可以提高阳性率。 附：肠道内正常菌群和粪便标本中常见病原体，见表 1-3-3。 表 1-3-3 肠道内正常菌群和粪便标本中常见病原体 正常菌群 常见病原体 革兰阳性细菌 葡萄球菌、粪链球菌、双歧杆 菌、乳杆菌、产气荚膜梭 菌、破伤风梭菌等 金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、厌氧链球菌、结核分枝杆 菌等 革兰阴性细菌 大肠埃希菌、产气杆菌、变形 杆菌、铜绿假单胞菌、类杆 菌等 致病性大肠埃希菌、志贺菌、伤寒沙门菌、其他沙门氏 菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森 军、弯曲菌等 其他 白假丝酵母菌 溶组织内阿米巴、贾第虫、隐孢子虫、肝吸虫、肺吸 虫、姜片虫、日本血吸虫、猪带绦虫和牛带绦虫、钩 虫、蛔虫、鞭虫等 【实验报告】 1. 记录本次实验的生化反应结果并解释。 2. 记录肥达试验的结果并分析讨论。 3. 以伤寒沙门菌引起的肠热症为例，设计检测实验流程，写出具体的操作 步骤，并对实验结果进行分析与讨论。 4. 描述醛醚沉淀法的实验步骤，记录镜下观察到的寄生虫卵，并绘制其 形态。 （李小翠 刘转转）
第一章综合性实验·17·第四节泌尿生殖道感染标本的病原生物检查尿路感染95%以上由单一病原体引起、其中最常见的是大肠埃希菌，其次是变形杆菌、产气杆菌、铜绿假单胞菌、粪链球菌和金黄色葡萄球菌等。生殖系统感染主要由淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、白假丝酵母菌和阴道毛滴虫等引起。【问题·思考】1.泌尿生殖道感染标本采集时应该注意哪些问题？2.如何鉴别滴虫性阴道炎和霉菌性阴道炎？阴道毛滴虫感染的致病机制是什么？0o00000【目的】1.知悉泌尿生殖道标本的采集方法以及病原体检验的一般程序。2.学习泌尿生殖道标本的细菌计数方法。【材料】1.标本尿液、生殖道脓液或渗出液、阴道分泌物、前列腺液。2.培养基肉汤、血平板、巧克力平板、克氏双糖铁（KIA）培养基、动力-哚-尿素（MIU）培养基、沙保弱培养基、甘露醇发酵管、肝浸液培养基等。3.试剂革兰染色液、抗酸染色液、1%的胰酶溶液、氧化酶试剂、1：2抗凝人血浆、3%过氧化氢液、生理盐水、Fontana镀银染色液、姬姆萨染液等。4.其他、载玻片、接种环、接种针、酒精灯、显微镜、普通培养箱、CO2培养箱、生物安全柜等。泌尿生殖道感染标本病原体检查的一般程序：见图1-4-1。【方法】1.标本采集与处理（1）尿液的采集方法1）中段尿采集法：女性患惠者先以肥皂水清洗，而后用1：1000的高锰酸溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿1020ml于无菌容器中送检。男性患者应翻转包皮，用1：1000新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前段尿，留取中段尿10~20ml于无菌容器中送检。2）导尿法：一般插人导管后弃去开始的15ml尿液，然后再留取10～20ml尿液。这种方法不建议采用，因为插入导管时，极容易将尿道中的细菌带人膀胱，增加医源性感染的危险。3）膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，于患者耻骨联合上消毒后，以无菌注射器穿刺抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者
第一章 综合性实验 ·17· 第四节 泌尿生殖道感染标本的病原生物检查 尿路感染 95%以上由单一病原体引起，其中最常见的是大肠埃希菌，其次是 变形杆菌、产气杆菌、铜绿假单胞菌、粪链球菌和金黄色葡萄球菌等。生殖系统 感染主要由淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、白假丝酵母菌和阴道毛滴虫等引起。 【问题·思考】 1. 泌尿生殖道感染标本采集时应该注意哪些问题？ 2. 如何鉴别滴虫性阴道炎和霉菌性阴道炎？阴道毛滴虫感染的致病机制 是什么？ 【目的】 1. 知悉泌尿生殖道标本的采集方法以及病原体检验的一般程序。 2. 学习泌尿生殖道标本的细菌计数方法。 【材料】 1. 标本 尿液、生殖道脓液或渗出液、阴道分泌物、前列腺液。 2. 培养基 肉汤、血平板、巧克力平板、克氏双糖铁（KIA）培养基、动力- 吲哚-尿素（MIU）培养基、沙保弱培养基、甘露醇发酵管、肝浸液培养基等。 3. 试剂 革兰染色液、抗酸染色液、1%的胰酶溶液、氧化酶试剂、1∶2 抗 凝人血浆、3%过氧化氢液、生理盐水、Fontana 镀银染色液、姬姆萨染液等。 4. 其他 载玻片、接种环、接种针、酒精灯、显微镜、普通培养箱、CO2 培养箱、生物安全柜等。 泌尿生殖道感染标本病原体检查的一般程序：见图 1-4-1。 【方法】 1. 标本采集与处理 （1）尿液的采集方法 1）中段尿采集法：女性患者先以肥皂水清洗，而后用 1∶1 000 的高锰酸钾 溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段 尿，留取中段尿 10～20ml 于无菌容器中送检。男性患者应翻转包皮，用 1∶1 000 新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前 段尿，留取中段尿 10～20ml 于无菌容器中送检。 2）导尿法：一般插入导管后弃去开始的 15ml 尿液，然后再留取 10～20ml 尿液。这种方法不建议采用，因为插入导管时，极容易将尿道中的细菌带入膀 胱，增加医源性感染的危险。 3）膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，于患者耻骨联合上消毒后，以无菌 注射器穿刺抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者
·18：病原生物学与免疫学实验一综合创新篇-尿液、生殖道标本77细菌、真菌学检查寄生虫检查++7直接涂片直接涂片分离培养+→+革兰染色血平板镜检免疫荧光染色巧克力平板镀银染色麦康凯培养基庆氧培养基+沙保弱培养基初步鉴定+菌落形态涂片染色+生化反应血清学鉴定+药敏试验图1-4-1泌尿生殖道标本病原体检查的一般程序4）留尿法：留取24h尿液，取沉淀部分约100ml送检。主要用于疑为泌尿道结核患者的检查。（2）生殖道脓液、渗出液等标本采集：采用泌尿生殖道拭子、宫颈刮片、精液等标本进行细菌学或其他病原体检测。1）若疑为淋病奈瑟菌，取泌尿生殖道脓液或宫颈口分泌物，标本采集后应注意保暖保湿，立即送检。2）若疑为无芽胞厌氧菌感染，生殖道标本应从感染深部吸取渗出物或汁，避免正常菌群的污染。3）若疑为梅毒螺旋体感染，取梅毒硬性下疽渗出液，低温保存并立即送检。4）若疑为阴道毛滴虫感染，可用无菌棉签在阴道后穹隆、子宫颈及阴道壁拭取分泌物，涂片，立即送检。2.形态学检查（1）直接涂片检查：生殖道脓液、渗出液、宫颈刮片标本可直接涂片检查，尿液标本需离心后，取沉淀涂片才可进行染色观察
·18· 病原生物学与免疫学实验——综合创新篇 图 1-4-1 泌尿生殖道标本病原体检查的一般程序 4）留尿法：留取 24h 尿液，取沉淀部分约 100ml 送检。主要用于疑为泌尿 道结核患者的检查。 （2）生殖道脓液、渗出液等标本采集：采用泌尿生殖道拭子、宫颈刮片、 精液等标本进行细菌学或其他病原体检测。 1）若疑为淋病奈瑟菌，取泌尿生殖道脓液或宫颈口分泌物，标本采集后应 注意保暖保湿，立即送检。 2）若疑为无芽胞厌氧菌感染，生殖道标本应从感染深部吸取渗出物或脓 汁，避免正常菌群的污染。 3）若疑为梅毒螺旋体感染，取梅毒硬性下疳渗出液，低温保存并立即 送检。 4）若疑为阴道毛滴虫感染，可用无菌棉签在阴道后穹隆、子宫颈及阴道壁 拭取分泌物，涂片，立即送检。 2. 形态学检查 （1）直接涂片检查：生殖道脓液、渗出液、宫颈刮片标本可直接涂片检 查，尿液标本需离心后，取沉淀涂片才可进行染色观察
第一章综合性实验·19·1）疑似细菌感染：将标本制成涂片，革兰染色，直接观察细菌的形态、排列、染色性。2）似真菌感染：为白假丝酵母菌可进行革兰染色镜检。3）疑似梅毒螺旋体感染：标本采用镀银染色法或直接在暗视野显微镜下观察其形态与运动方式。4）疑似阴道毛滴虫感染：在载玻片上滴1滴生理盐水，将阴道分泌物、尿液沉渣或前列腺液与生理盐水混合涂片，加盖玻片镜检。也可将涂片晾干后，甲醇固定，姬姆萨染色镜检。（2）尿液的活菌数计数1）直接计数法：将尿液标本混匀，取一滴尿液于载玻片上，盖上盖玻片，用相差显微镜观察每个视野的细菌数，可大致估计尿液中的细菌数。如每视野有100个以上的细菌，则尿液中的细菌数约为≥10℃cfu/ml；每视野有10个以上的细菌，则尿液中的细菌数约为≥10cfu/ml；每视野有1个以上的细菌，则尿液中的细菌数约为≥10°cfu/ml；可同时观察细菌的形态和运动情况。也可将0.001ml尿液涂布在玻片上进行革兰染色，用油镜观察，如每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥10°cfu/ml。2）定量接种法：用定量接种环取尿液。在血平板上连续划线接种；或用无菌移液器吸取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取0.1ml于血平板上涂布接种，37℃培养箱中孵育18～24h，计数平板上生长的菌落数。乘1000即得每毫升尿液中细菌数。3）倾注培养法：取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取1ml于无菌平板中，加入已融化并冷却至50℃的普通琼脂培养基，立即混匀，凝固后37℃培养箱中孵育18～24h，计数平板上生长的菌落数。乘100即为每毫升尿液中的细菌数。3.分离培养（1）病原菌的分离培养：将尿液标本离心后取沉淀、生殖道脓液、渗出液标本分别接种于血平板、巧克力平板及麦康凯平板培养基等，37℃孵育18～24h，观察有无菌落生长，根据菌落特征和革兰染色镜检结果作进一步鉴定。为检出特定的病原体，可采用以下特殊的培养方法：1）淋病奈瑟菌培养：将标本接种于巧克力平板，37℃、5%CO2孵育18～24h，取菌落作进一步鉴定。2）厌氧菌培养：将标本接种于厌氧血平板或厄肉培养基，放置在厌氧环境，37℃孵育2～7d，每天观察一次，如有菌生长，进一步作细菌学检查。3）真菌培养：标本可接种于沙保弱培养基，37℃培养2～7d，进行鉴定。（2）寄生虫培养：如疑是阴道毛滴虫，将阴道分泌物接种于肝浸液培养基，置于37℃培养48h，用吸管将培养液和虫体混匀，取1滴涂片镜检
第一章 综合性实验 ·19· 1）疑似细菌感染：将标本制成涂片，革兰染色，直接观察细菌的形态、排 列、染色性。 2）疑似真菌感染：疑为白假丝酵母菌可进行革兰染色镜检。 3）疑似梅毒螺旋体感染：标本采用镀银染色法或直接在暗视野显微镜下观 察其形态与运动方式。 4）疑似阴道毛滴虫感染：在载玻片上滴 1 滴生理盐水，将阴道分泌物、尿 液沉渣或前列腺液与生理盐水混合涂片，加盖玻片镜检。也可将涂片晾干后，甲 醇固定，姬姆萨染色镜检。 （2）尿液的活菌数计数 1）直接计数法：将尿液标本混匀，取一滴尿液于载玻片上，盖上盖玻片， 用相差显微镜观察每个视野的细菌数，可大致估计尿液中的细菌数。如每视野有 100 个以上的细菌，则尿液中的细菌数约为≥106 cfu/ml；每视野有 10 个以上的 细菌，则尿液中的细菌数约为≥105 cfu/ml；每视野有 1 个以上的细菌，则尿液中 的细菌数约为≥104 cfu/ml；可同时观察细菌的形态和运动情况。也可将 0.001ml 尿液涂布在玻片上进行革兰染色，用油镜观察，如每视野有 1 个以上的细菌则尿 液中的细菌数约为≥105 cfu/ml。 2）定量接种法：用定量接种环取尿液。在血平板上连续划线接种；或用无 菌移液器吸取 0.1ml 尿液标本用 9.9ml 无菌生理盐水稀释后，取 0.1ml 于血平板 上涂布接种，37℃培养箱中孵育 18～24h，计数平板上生长的菌落数。乘 1000 即得每毫升尿液中细菌数。 3）倾注培养法：取 0.1ml 尿液标本用 9.9ml 无菌生理盐水稀释后，取 1ml 于无菌平板中，加入已融化并冷却至 50℃的普通琼脂培养基，立即混匀，凝固 后 37℃培养箱中孵育 18～24h，计数平板上生长的菌落数。乘 100 即为每毫升尿 液中的细菌数。 3. 分离培养 （1）病原菌的分离培养：将尿液标本离心后取沉淀、生殖道脓液、渗出液 标本分别接种于血平板、巧克力平板及麦康凯平板培养基等，37℃孵育 18～ 24h，观察有无菌落生长，根据菌落特征和革兰染色镜检结果作进一步鉴定。为 检出特定的病原体，可采用以下特殊的培养方法： 1）淋病奈瑟菌培养：将标本接种于巧克力平板，37℃、5%CO2 孵育 18～ 24h，取菌落作进一步鉴定。 2）厌氧菌培养：将标本接种于厌氧血平板或庖肉培养基，放置在厌氧环 境，37℃孵育 2～7d，每天观察一次，如有菌生长，进一步作细菌学检查。 3）真菌培养：标本可接种于沙保弱培养基，37℃培养 2～7d，进行鉴定。 （2）寄生虫培养：如疑是阴道毛滴虫，将阴道分泌物接种于肝浸液培养 基，置于 37℃培养 48h，用吸管将培养液和虫体混匀，取 1 滴涂片镜检
·20：病原生物学与免疫学实验一一综合创新篇4.生化反应及血清学反应分离培养后，挑取可疑的菌落，进一步行生化反应、血清学实验或荧光抗体染色等检测，进行细菌的鉴别。5.药敏试验可用纸片扩散法检测致病菌对各种抗生素的敏感性，寻找敏感药物，指导临床治疗。【结果】1.若革兰阴性杆菌尿液菌落计数<10*cfu/ml可判断为污染，>10°cfu/ml可判断为感染，10～10°cfu/ml为可疑需重复检查。对于革兰阳性球菌而言尿液菌落计数>10°cfu/ml可判断为感染。2.如活的阴道毛滴虫感染，其滋养体在低倍镜下可以见到虫体为呈梨形，无色半透明，运动活泼。高倍镜下可见到该虫的鞭毛，波动膜和伸出体后的轴柱。姬姆萨染色后的虫体用油镜观察，其形态结构参考基础篇。3.如革兰阴性杆菌感染氧化酶阴性并发酵葡萄糖者初步判断为肠杆菌科细菌。KIA、MIU培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清作玻片凝集试验后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，参见肠杆菌科其他菌属生化进行鉴定。尿液中常见革兰阴性杆菌的生化反应鉴定参见表1-4-1。表1-4-1尿液中常见革兰阴性杆菌的生化反应鉴定O/FKIA硝酸盐MIU常见菌属氧化酶斜面底层动力吲噪脲酶还原试验试验产气H2S+FAA++-+大肠埃希菌一-A+FA++一克雷伯菌属+一-F+KA沙门菌属一++一+国+FKA变形杆菌属x*+一+一0KK假单胞菌属++/产气+/++弧菌科+FAA+注：O/F试验为氧化发酵试验4.如革兰阳性球菌感染根据细菌形态结构特点、培养特征、生化反应等进行鉴定。若为葡萄状排列，血平板上中等天小、突起、湿润的圆形金黄色菌落，有β-溶血环，发酵甘露醇，血浆凝固酶试验阳性，新生霉素敏感，耐热核酸酶阳性，疑为金黄色葡萄球菌。若为链状排列，血平板上灰白色、表面光滑、边缘整齐的圆形菌落，则可能为链球菌或肠球菌。若有β-溶血环，不分解菊糖，不被胆汁溶解，疑为链球菌：若典型菌落不溶血，偶可出现α或β-溶血环，且能在pH9.6、6.5%氯化钠和400g/L胆盐中生长，疑为肠球菌。5.如疑似厌氧菌感染生殖道标本有恶臭，无芽抱厌氧菌消化链球菌最为常见，为革兰阳性球菌，生长缓慢，厌氧培养需5～7d，再经生化反应鉴定
·20· 病原生物学与免疫学实验——综合创新篇 4. 生化反应及血清学反应 分离培养后，挑取可疑的菌落，进一步行生化 反应、血清学实验或荧光抗体染色等检测，进行细菌的鉴别。 5. 药敏试验 可用纸片扩散法检测致病菌对各种抗生素的敏感性，寻找敏 感药物，指导临床治疗。 【结果】 1. 若革兰阴性杆菌尿液菌落计数＜104 cfu/ml 可判断为污染，＞105 cfu/ml 可 判断为感染，104 ～105 cfu/ml 为可疑需重复检查。对于革兰阳性球菌而言尿液菌 落计数＞104 cfu/ml 可判断为感染。 2. 如活的阴道毛滴虫感染，其滋养体在低倍镜下可以见到虫体为呈梨形， 无色半透明，运动活泼。高倍镜下可见到该虫的鞭毛，波动膜和伸出体后的轴 柱。姬姆萨染色后的虫体用油镜观察，其形态结构参考基础篇。 3. 如革兰阴性杆菌感染 氧化酶阴性并发酵葡萄糖者初步判断为肠杆菌科 细菌。KIA、MIU 培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清作 玻片凝集试验后确认血清型；KIA、MIU 培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他 菌属，参见肠杆菌科其他菌属生化进行鉴定。尿液中常见革兰阴性杆菌的生化反 应鉴定参见表 1-4-1。 表 1-4-1 尿液中常见革兰阴性杆菌的生化反应鉴定 常见菌属 氧化酶 硝酸盐 还原试验 O/F 试验 KIA MIU 斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 大肠埃希菌 — + F A A + — + + — 克雷伯菌属 — + F A A + — — +/— +/— 沙门菌属 — + F K A —/+ +/— + — — 变形杆菌属 — + F K A + + — +/— + 假单胞菌属 + +/产气 O K K — — + — — 弧菌科 + + F A A + — + 注：O/F 试验为氧化发酵试验 4. 如革兰阳性球菌感染 根据细菌形态结构特点、培养特征、生化反应等 进行鉴定。若为葡萄状排列，血平板上中等大小、突起、湿润的圆形金黄色菌 落，有-溶血环，发酵甘露醇，血浆凝固酶试验阳性，新生霉素敏感，耐热核酸 酶阳性，疑为金黄色葡萄球菌。若为链状排列，血平板上灰白色、表面光滑、边 缘整齐的圆形菌落，则可能为链球菌或肠球菌。若有-溶血环，不分解菊糖，不 被胆汁溶解，疑为链球菌；若典型菌落不溶血，偶可出现 α 或-溶血环，且能在 pH9.6、6.5%氯化钠和 400g/L 胆盐中生长，疑为肠球菌。 5. 如疑似厌氧菌感染 生殖道标本有恶臭，无芽孢厌氧菌消化链球菌最为 常见，为革兰阳性球菌，生长缓慢，厌氧培养需 5～7d，再经生化反应鉴定