代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础 上,应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支 点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代 谢网络。 其主要步骤为 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶 取得酶基因,必要时可用蛋白质工程技术,如 定点诱变,基因剪接等,使蛋白具有新的特点 (增强活性或稳定性、解除反馈抑制等) 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节 元件一起克隆进目标生物 使调节元件的作用及培育条件最优化
• 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础 上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支 点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代 谢网络。 • 其主要步骤为: • 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶); • 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如 定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点 (增强活性或稳定性、解除反馈抑制等); • 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节 元件一起克隆进目标生物; • 使调节元件的作用及培育条件最优化
3.1载体受体系统及克隆表 达的研究 3.1.1受体的获得 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌 K-12及棒状杆菌家族,通常是通过诱变选育出 的基础产率较高的菌株 大肠杆菌遗传背景研究得清楚,载体系统完善, 利于工程菌的构建,但它含有内毒素且不能将 蛋白产物分泌至胞外,为应用带来困难。 ·棒状杆菌能克服这两个缺点,但载体受体系统 研究较晩且有限制修饰系统的障碍,所以获得 利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体 菌是尚待解决的问题
3.1 载体-受体系统及克隆表 达的研究 • 3.1.1 受体的获得 • 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌 K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出 的基础产率较高的菌株。 • 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善， 利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将 蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。 • 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统 研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得 利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体 菌是尚待解决的问题
3.1.2载体的构建 有效的载体需要有在受体菌中可启动的 复制起始位点,这可从棒状杆菌家族内 源小质粒中获得; 载体所需的筛选标记及外源基因插入的 多克隆位点,可从常用的克隆载体中获 得
3.1.2 载体的构建 • 有效的载体需要有在受体菌中可启动的 复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内 源小质粒中获得; • 载体所需的筛选标记及外源基因插入的 多克隆位点，可从常用的克隆载体中获 得
3.1.3基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌,CaCl2转化法对它 不适用 通常采用的方法有原生质体转化、转导,电转化 接合转移。 原生质体转化的方法是较早采用的方法,由于受 到原生质体再生条件的局限,效率不高; ·电转化方法由于高效,快速被广泛使用,目前它 的转化效率可达到原生质体转化法的100~1000倍。 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的 转移,并且可将外源基因整合于染色体上,易于 稳定遗传
3.1.3 基因转移手段 • 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它 不适用。 • 通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化， 接合转移。 • 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受 到原生质体再生条件的局限，效率不高; • 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它 的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍。 • 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的 转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于 稳定遗传