酸性时呈红色,在碱性时呈淡黄色。凡能分解乳糖的细菌,因为有酸类产生,能使指示剂变 红,所以菌落呈现红色:不分解乳糖的细菌,由于它分解蛋白胨产生碱性物质,所以菌落呈 淡黄色:能分解蛋白质产生HS的细菌可与含铁化合物作用而使菌落带有黑色或形成黑心。 此外,培养基中含有煌绿,可抑制革兰氏阳性菌生长;胆盐与枸櫞酸钠、硫代硫酸钠合 用,能加强对大肠杄菌的抑制作用;枸橼酸铁尚能中和煌绿、中性红等染料的毒性作用。 【用途】 分离沙门菌和志贺菌。大肠埃希菌分解乳糖产酸,通过中性红指示剂呈红色菌落,同时 由于与胆盐结合成胆酸发生沉淀,故菌落中心混浊。硫代硫酸钠有缓和胆盐对致病菌的有害 作用,并能中和煌绿和中性红染料的毒性。 (七)麦康凯琼脂(MAC) 【材料与方法】 蛋白胨200g,氯化钠5.0g,乳糖100g,胆盐50g,中性红0.3g,结晶紫001g,琼脂150g, 蒸馏水1000m 将以上各成分(中性红与结晶紫除外)加热溶解于1000ml水中,调pH7.1±0.2。然后加 入0.1%结晶紫水溶液1ml和1%中性红水溶液3ml,于121℃灭菌15min 【用途】 弱选择性平板培养基,主要用于分解乳糖的肠道致病菌 【原理】胆盐能抑制部分革兰阳性菌及部分非病原菌的生长,但能促进某些革兰阴性病 原菌生长:因为含有乳糖及中性红指示剂,故分解乳糖的细菌,菌落呈红色(如大肠杆菌), 不分解乳糖的细菌,菌落不呈红色 (八)双糖铁培养基(用成品制备) 【成分】 上层:蛋白胨 Ig 下层:蛋白胨 乳糖 1g 葡萄糖 硫酸亚铁铵0.02g 氯化钠 0.5g 氯化钠 酚红 酚红 琼脂 0.3g 琼脂 1.1g 【制法】(1)先称取下层粉末2克加入100m蒸馏水,放置数分钟后加热溶解,分装于 试管中,于8磅15分钟灭菌,取出后垂直凝固,待此下层培养基凝固后,再以无菌操作方 法加入上层培养基 (2)称取上层粉末365克加入10om蒸馏水,放置数分钟后加热溶解装瓶,于8磅15 分钟灭菌后冷却至70℃左右,再以无菌操作加到凝固的下层培养基上面,立即制成斜面备 用 【原理】培养基中除含有基础营养成分外,以酚红作指示剂(碱性时为红色,酸性时为 黄色),可鉴别细菌分解其中糖类及氨基酸的能力,凡能分解葡萄糖的,则使培养基底层变 黄,凡能分解乳糖的,则使斜面变黄;能分解糖类产生气体的,可使培养基断裂后出现气泡 能分解含硫氨基酸的,可产生H2S与硫酸亚铁生成黑色化合物,使培养基显示黑色 (九)疱肉培养基 【材料与方法】 牛肉浸液100oml,蛋白胨30.0g,酵母膏50g,磷酸二氢钠5.0g,葡萄糖30g,可溶性淀
13 酸性时呈红色，在碱性时呈淡黄色。凡能分解乳糖的细菌，因为有酸类产生，能使指示剂变 红，所以菌落呈现红色；不分解乳糖的细菌，由于它分解蛋白胨产生碱性物质，所以菌落呈 淡黄色；能分解蛋白质产生 H2S 的细菌可与含铁化合物作用而使菌落带有黑色或形成黑心。 此外，培养基中含有煌绿，可抑制革兰氏阳性菌生长；胆盐与枸橼酸钠、硫代硫酸钠合 用，能加强对大肠杆菌的抑制作用；枸橼酸铁尚能中和煌绿、中性红等染料的毒性作用。 【用途】 分离沙门菌和志贺菌。大肠埃希菌分解乳糖产酸，通过中性红指示剂呈红色菌落，同时 由于与胆盐结合成胆酸发生沉淀，故菌落中心混浊。硫代硫酸钠有缓和胆盐对致病菌的有害 作用，并能中和煌绿和中性红染料的毒性。 （七）麦康凯琼脂（MAC） 【材料与方法】 蛋白胨20.0g，氯化钠5.0g，乳糖10.0 g，胆盐5.0g，中性红0.3g，结晶紫0.001g，琼脂15.0g， 蒸馏水1000ml。 将以上各成分（中性红与结晶紫除外）加热溶解于1000ml水中，调pH7.1±0.2。然后加 入0.1%结晶紫水溶液1 ml和1%中性红水溶液3ml，于121℃灭菌15min 【用途】 弱选择性平板培养基，主要用于分解乳糖的肠道致病菌。 【原理】胆盐能抑制部分革兰阳性菌及部分非病原菌的生长，但能促进某些革兰阴性病 原菌生长；因为含有乳糖及中性红指示剂，故分解乳糖的细菌，菌落呈红色（如大肠杆菌）， 不分解乳糖的细菌，菌落不呈红色。 （八）双糖铁培养基（用成品制备） 【成分】 上层：蛋白胨 1g 下层： 蛋白胨 1g 乳糖 1g 葡萄糖 0.2g 硫酸亚铁铵 0.02g 氯化钠 0.5g 氯化钠 0.5g 酚红 2mg 酚红 2mg 琼脂 0.3g 琼脂 1.1g 【制法】（1）先称取下层粉末 2 克加入 100ml 蒸馏水，放置数分钟后加热溶解，分装于 试管中，于 8 磅 15 分钟灭菌，取出后垂直凝固，待此下层培养基凝固后，再以无菌操作方 法 加入上层培养基。 （2）称取上层粉末 3.65 克加入 100ml 蒸馏水，放置数分钟后加热溶解装瓶，于 8 磅 15 分钟灭菌后冷却至 70℃左右，再以无菌操作加到凝固的下层培养基上面，立即制成斜面备 用。 【原理】培养基中除含有基础营养成分外，以酚红作指示剂（碱性时为红色，酸性时为 黄色），可鉴别细菌分解其中糖类及氨基酸的能力，凡能分解葡萄糖的，则使培养基底层变 黄，凡能分解乳糖的，则使斜面变黄；能分解糖类产生气体的，可使培养基断裂后出现气泡； 能分解含硫氨基酸的，可产生 H2S 与硫酸亚铁生成黑色化合物， 使培养基显示黑色。 （九）疱肉培养基 【材料与方法】 牛肉浸液1000ml，蛋白胨30.0g，酵母膏5.0g，磷酸二氢钠5.0g，葡萄糖3.0g，可溶性淀
粉20g,碎肉渣适量,pH78。 称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉500g,加蒸馏水100m1和lmol氢氧化钠溶液25ml,搅 拌煮沸15min,充分冷却,除去表层脂肪,澄清,过滤加水补足至1000ml。加入除碎肉渣外 各种成分,校正pH。碎肉渣经水洗后凉至半干,分装15m×150m试管2~3cm高,每管加还 原铁粉0.1~0.2g或铁屑少许。将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1cm。上面覆 盖溶化的凡士林或液体石蜡0.3~0.4cm。121℃灭菌15mins 【用途】 用于肉毒梭菌的增菌培养。 (十)“ Lowenstein- Jensen”培养基(罗氏培养基) 【材料与方法】 磷酸二氢钾0.%6g,硫酸镁(MgSO7H2O)0.048g,天门冬酰胺0.72g,甘油(中性) 24ml,枸櫞酸镁0.l2g,蒸馏水12oml,马铃薯粉6.0g,新鲜鸡蛋6~8只,1%孔雀绿溶液 8ml 1、将天门冬酰胺,磷酸二氢钾,枸橼酸镁及甘油加水后,置沸水浴中加热溶解。 2、加入马铃薯粉,继续在沸水浴中加热30分钟,时加搅拌,使成均匀糊状 3、待冷至60℃,加入新鲜全蛋液200ml及1%孔雀绿8ml,充分搅匀后,用双层纱布 4、分装于20×150mm试管中,每管约8ml,塞紧,置成长斜面。 5、用85℃50分钟流通蒸气灭菌后,经37℃孵育48小时,证明无菌生长:冷置备用。 6、管内如无凝结水,可加无菌生理盐水0.5m以防在贮存期中培养基干燥 7、以无菌操作换上软木塞,置37℃培养48小时,无菌生长即可应用。 【用途】 主要用于分枝杆菌的分离培养。 (十一)巧克力色琼脂平板的制备 【材料】肉汤琼脂100m无菌脱纤维羊或兔血10ml 【方法】 (1)将肉汤琼脂加热溶化,趁热加入脱纤维血,摇匀 (2)倾注平板,待冷却成巧克力色,备用。 【用途】用于培养脑膜炎双球菌或淋球菌。 【说明】加血一定要趁热加。 二、细菌培养接种技术 细菌培养技术可以纯化细菌,了解细菌的生长特征,进一步检测细菌生化反应、变异性, 制备细菌抗原,进行分子生物学工作等。了解细菌的培养特征也有助于鉴别细菌 由于细菌感染而致病的各种标本及带菌者所需检查的各种标本,往往并非单一的细菌 而且混有其它非致病菌(人体正常菌群)。因此当对此标本需作出细菌鉴定时,就必须从标 本中分离出致病菌,称为细菌分高培养技术。另外,对已得到可疑病菌进行细菌鉴定及菌种 保存等培养,称为纯培养接种技术。 在微生物学实验中,无菌操作主要包括斜面接种、液体接种、平板接种、倒制平板和稀 释分离等
14 粉2.0g，碎肉渣适量，pH7.8。 称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉500g，加蒸馏水1000ml和1mol/L氢氧化钠溶液25ml，搅 拌煮沸15min，充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤加水补足至1000ml。加入除碎肉渣外 各种成分，校正pH。碎肉渣经水洗后凉至半干，分装15㎜×150㎜试管2～3㎝高，每管加还 原铁粉0.1～0.2 g或铁屑少许。将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1㎝。上面覆 盖溶化的凡士林或液体石蜡0.3～0.4㎝。121℃灭菌15min。 【用途】 用于肉毒梭菌的增菌培养。 （十） “Lowenstein-Jensen”培养基（罗氏培养基） 【材料与方法】 磷酸二氢钾 0.96g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.048g，天门冬酰胺 0.72g，甘油（中性） 2.4ml，枸橼酸镁 0.12g，蒸馏水 120ml，马铃薯粉 6.0g，新鲜鸡蛋 6～8 只，1%孔雀绿溶液 8ml 1、将天门冬酰胺，磷酸二氢钾，枸橼酸镁及甘油加水后，置沸水浴中加热溶解。 2、加入马铃薯粉，继续在沸水浴中加热 30 分钟，时加搅拌，使成均匀糊状。 3、待冷至 60℃，加入新鲜全蛋液 200ml 及 1％孔雀绿 8ml，充分搅匀后，用双层纱布 过滤。 4、分装于 20×150mm 试管中，每管约 8ml，塞紧，置成长斜面。 5、用 85℃50 分钟流通蒸气灭菌后，经 37℃孵育 48 小时，证明无菌生长；冷置备用。 6、管内如无凝结水，可加无菌生理盐水 0.5ml 以防在贮存期中培养基干燥。 7、以无菌操作换上软木塞，置 37℃培养 48 小时，无菌生长即可应用。 【用途】 主要用于分枝杆菌的分离培养。 （十一）巧克力色琼脂平板的制备 【材料】肉汤琼脂100ml 无菌脱纤维羊或兔血10ml。 【方法】 （1）将肉汤琼脂加热溶化，趁热加入脱纤维血，摇匀。 （2）倾注平板，待冷却成巧克力色，备用。 【用途】用于培养脑膜炎双球菌或淋球菌。 【说明】加血一定要趁热加。 二、 细菌培养接种技术 细菌培养技术可以纯化细菌，了解细菌的生长特征，进一步检测细菌生化反应、变异性， 制备细菌抗原，进行分子生物学工作等。了解细菌的培养特征也有助于鉴别细菌。 由于细菌感染而致病的各种标本及带菌者所需检查的各种标本，往往并非单一的细菌， 而且混有其它非致病菌（人体正常菌群）。因此当对此标本需作出细菌鉴定时，就必须从标 本中分离出致病菌，称为细菌分离培养技术。另外，对已得到可疑病菌进行细菌鉴定及菌种 保存等培养，称为纯培养接种技术。 在微生物学实验中，无菌操作主要包括斜面接种、液体接种、平板接种、倒制平板和稀 释分离等
(一)平板划线接种法(又称分离培养法,图3-1) 平板分离划线的方法较多,其中以分区划线法与曲线划线法较为常用。其目的都要使细 菌呈现单个菌落生长,便于同杂菌菌落鉴别。现只介绍分区划线法。 【材料】 细菌:大肠杆菌、葡萄球菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。 2.培养基:普通琼脂平板。 3.酒精灯,接种环等 【方法】 用接种环挑取菌种后在平板上经分段划线分离,可得到纯种细菌。 图3-1平板划线法 图3-2几种划线方式示意图 图3-3平板划线法 图3-4孵育后菌落的生长情况 ①在酒精灯火焰上灼烧接种环,待冷却,取一接种环金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混 合菌液。 ②左手握住琼脂平板,用大拇指和食指稍抬起皿盖,同时靠近火焰周围,右手持接种 环伸入皿内,在平板上一个区域作“之”形来回划线。划线时使接种环与平板表面成30° 40°角轻轻接触,以腕力在表面作较快的滑动,勿使平板表面划破或嵌进培养基内。 ③灼烧接种环,以杀灭接种环上剩余的菌液。待冷却后,再将平皿转动一定的角度
15 （一）平板划线接种法（又称分离培养法,图3-1） 平板分离划线的方法较多，其中以分区划线法与曲线划线法较为常用。其目的都要使细 菌呈现单个菌落生长，便于同杂菌菌落鉴别。现只介绍分区划线法。 【材料】 1. 细菌：大肠杆菌、葡萄球菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。 2. 培养基：普通琼脂平板。 3. 酒精灯，接种环等。 【方法】 用接种环挑取菌种后在平板上经分段划线分离，可得到纯种细菌。 图 3-1 平板划线法 图 3-2 几种划线方式示意图 ① 在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷却，取一接种环金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混 合菌液。 ② 左手握住琼脂平板，用大拇指和食指稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种 环伸入皿内，在平板上一个区域作“之”形来回划线。划线时使接种环与平板表面成 30º～ 40º角轻轻接触，以腕力在表面作较快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进培养基内。 ③ 灼烧接种环，以杀灭接种环上剩余的菌液。待冷却后，再将平皿转动一定的角度， 图 3-3 平板划线法 图 3-4 孵育后菌落的生长情况
接种环通过划过线的区域,在第二区域继续划线。 ④划毕后再灼烧接种环,冷却后用同样的方法在其它区划线。 ⑤全部划线完毕后,在平皿底注明菌种、组别、姓名和日期等。将培养皿倒置放入恒 温箱培养。 ⑥适当温度培养一段时间后,取出观察 (二)纯培养细菌接种法 1.斜面培养基接种法:用于培养,保存菌种及其它实验用。 【材料】 (1)大肠杆菌,葡萄球菌18~24小时琼脂斜面培养物。 (2)普通琼脂斜面培养基 (3)接种环,接种针,酒精灯等。 【方法】 B 图3-5斜面接种时的无菌操作 (1)接种环灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)管口灭菌,盖好试 管塞 ①操作前,先用75%乙醇擦手,待乙醇挥发后才能点燃酒精灯。 ②将斜面菌种管和欲接种的斜面试管同时拿在左手的大拇指和其它四指之间,长有菌 苔的一面向上,并处于水平位置。 ③先将菌种管和试管的棉塞旋松,便于接种时取出。 ④右手拿接种环,与通常拿笔一样。将要伸入管内部分的金属柄和金属丝在酒精灯焰 上灼烧灭菌。 ⑤用右手小指、无名指及手掌将菌种管和试管的棉塞同时拔出,并把棉塞握住,不要 随意放在桌上或与其它物品相接触,再以火焰烧管口 ⑥将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内,接取菌种前先在管内壁上或未长苔 的培养基面上接触一下,使接种环充分冷却,以免烫死菌种。用接种环轻轻刮取少许苔后, 自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰,也勿再通过火焰。迅速将沾有菌种的接环伸入待接 种的斜面培养基试管内,由里到外划折线,使菌体粘附于培养基上。划线时,勿用力划破培
16 接种环通过划过线的区域，在第二区域继续划线。 ④ 划毕后再灼烧接种环，冷却后用同样的方法在其它区划线。 ⑤ 全部划线完毕后，在平皿底注明菌种、组别、姓名和日期等。将培养皿倒置放入恒 温箱培养。 ⑥ 适当温度培养一段时间后，取出观察。 （二）纯培养细菌接种法 1. 斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种及其它实验用。 【材料】 （1）大肠杆菌，葡萄球菌18~24小时琼脂斜面培养物。 （2）普通琼脂斜面培养基。 （3）接种环，接种针，酒精灯等。 【方法】 图 3－5 斜面接种时的无菌操作 (1) 接种环灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)管口灭菌，盖好试 管塞 ① 操作前，先用 75％乙醇擦手，待乙醇挥发后才能点燃酒精灯。 ② 将斜面菌种管和欲接种的斜面试管同时拿在左手的大拇指和其它四指之间，长有菌 苔的一面向上，并处于水平位置。 ③ 先将菌种管和试管的棉塞旋松，便于接种时取出。 ④ 右手拿接种环，与通常拿笔一样。将要伸入管内部分的金属柄和金属丝在酒精灯焰 上灼烧灭菌。 ⑤ 用右手小指、无名指及手掌将菌种管和试管的棉塞同时拔出，并把棉塞握住，不要 随意放在桌上或与其它物品相接触，再以火焰烧管口。 ⑥ 将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，接取菌种前先在管内壁上或未长苔 的培养基面上接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。用接种环轻轻刮取少许苔后， 自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿再通过火焰。迅速将沾有菌种的接环伸入待接 种的斜面培养基试管内，由里到外划折线，使菌体粘附于培养基上。划线时，勿用力划破培
养基。若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可 ⑦接种完毕后将接种环抽出,灼烧管口,塞上棉塞。加棉塞时,不要用试管口去迎塞, 以免试管在移动时污染杂菌 ⑧接种环在放回原位前,要经火焰灼烧灭菌。接种菌应作好标记,标明菌种名称,日 期等,置37℃温箱中培养,次日观察结果。 2.液体培养基接种法:用于增菌及鉴定细菌生长特点,如表面生长,沉淀生长,均匀 混浊生长等。 【材料与方法】 ①由斜面菌种接入液体试管培养基:操作方法与前面的斜面接种相同,但应使液体管 口向上倾斜,以免培养液流岀。接入菌体后,让接种环与管内壁轻轻硏磨,使菌体从接种环 上脱落到溶液中。接种后塞好棉塞,将试管在手掌中轻轻敲打,使菌体充分分散 ②由液体培养基接种液体试管培养基:菌种如为液体时,接种除用接种环外,也可无 菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞,用无菌吸管吸取菌液后注入培养液内,摇匀即可。 置37℃温箱中培养,次日观察结果 3.半固体培养基穿刺培养法 用于保存菌种及间接观察细菌之动力(无动力之细菌仅沿穿刺线生长,清晰可见:有动 力的细菌使培养基呈现混浊样,穿刺线甚至难以看出) 用无菌操作技术,灭菌穿刺针沾取细菌后,垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处, 再沿原穿刺线抽出即可,置37℃温箱培养,次日观察结果。 【附注】 校正pH的方法为 ①取三支与标准比色管(pH7.6)相同的空比色管,其中一管内盛放蒸馏水5ml;另外两 管各加入欲测的肉汤培养基5ml,其中一管内加0.02%酚红指示剂0.25m(滴定管),摇匀 ②按图3-6所示排列,举起比色架,对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色,即表示 标准比色管培养基加指示剂 0 培养基 蒸馏水 图3-6pH比色架 培养基偏酸性,需滴加o. Imol/L Naoh矫正;若呈深红色,即表示偏碱性,应滴加0.Imo/HCl 矫正:使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH (或lCl1)溶液量,由此计算出矫正全量培养基时所需NaOH(或HC1)溶液量。 实验四细菌的分布与无菌操作技术
17 养基。若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。 ⑦ 接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。加棉塞时，不要用试管口去迎塞， 以免试管在移动时污染杂菌。 ⑧ 接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。接种菌应作好标记，标明菌种名称，日 期等，置 37℃温箱中培养，次日观察结果。 2. 液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特点，如表面生长，沉淀生长，均匀 混浊生长等。 【材料与方法】 ① 由斜面菌种接入液体试管培养基：操作方法与前面的斜面接种相同，但应使液体管 口向上倾斜，以免培养液流出。接入菌体后，让接种环与管内壁轻轻研磨，使菌体从接种环 上脱落到溶液中。接种后塞好棉塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。 ② 由液体培养基接种液体试管培养基：菌种如为液体时，接种除用接种环外，也可无 菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞，用无菌吸管吸取菌液后注入培养液内，摇匀即可。 置 37℃温箱中培养，次日观察结果。 3. 半固体培养基穿刺培养法 用于保存菌种及间接观察细菌之动力（无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动 力的细菌使培养基呈现混浊样，穿刺线甚至难以看出）。 用无菌操作技术，灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处， 再沿原穿刺线抽出即可，置37℃温箱培养，次日观察结果。 【附注】 校正pH的方法为： ①取三支与标准比色管（pH7.6）相同的空比色管，其中一管内盛放蒸馏水5ml；另外两 管各加入欲测的肉汤培养基5ml，其中一管内加0.02%酚红指示剂0.25ml（滴定管），摇匀。 ②按图3-6所示排列，举起比色架，对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示 图 3-6 pH 比色架 培养基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/L HCl 矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH （或HCl）溶液量，由此计算出矫正全量培养基时所需NaOH（或HCl）溶液量。 实验四 细菌的分布与无菌操作技术