实验技术 常用细菌培养基制备 感染性疾病的诊断关键在于病原菌的分离与鉴定,人工培养法为细菌提供必 要的生长条件,使其在体外生长繁殖。本章着重介绍常用细菌培养基的制备、细 菌的接种方法及生化反应鉴定法,最后简介了内毒素的检测。要求同学们了解培 养基的制作原则和方法,掌握细菌的分离培养技术 培养基是指在人工培养细菌时,提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制 品。基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源 和无杋盐等。在基础培养基的基础上添加一些特殊成分(如糖类、血液、抑制剂 等)则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等 (一)肉汤培养基 肉汤培养基是常用的液体培养基,也是制备常用的细菌分离培养基及其他某些培 养基的基础 【材料】 鲜牛肉(去脂肪和肌腱)、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10%碳酸氢钠、试管 角烧瓶、蒸馏水等。 【方法】 1.将新鲜牛肉500g切碎或搅碎,加水100mn,放4℃冰箱或冷处浸泡过夜,然 后煮沸30min,放凉,使残余的脂肪凝固,再用绒布或滤纸过滤,将滤液补足为 原量。此溶液称为肉水或肉浸液 2.1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化钠5g,加热溶解,放凉。 3.用精密pH试纸测酸碱度,用10%碳酸氢钠校正p为72左右。过碱时,可 用10%醋酸校正之。 4.分装于试管中或三角烧瓶中,15磅(121℃高压蒸气灭菌20~30min 如用市售的牛肉膏代替新鲜肉水时,可将牛肉膏溶成0.3~0.5%的水溶液,再如 上法制成培养基 (二)普通琼脂培养基 普通琼脂培养基是常用的固体培养基,包括普通琼脂平板和普通琼脂斜面两种, 前者用于分离纯种细菌,后者用于增殖纯种细菌或保存菌种 【材料】 ①肉水200ml
实验技术 一、常用细菌培养基制备 感染性疾病的诊断关键在于病原菌的分离与鉴定，人工培养法为细菌提供必 要的生长条件，使其在体外生长繁殖。本章着重介绍常用细菌培养基的制备、细 菌的接种方法及生化反应鉴定法，最后简介了内毒素的检测。要求同学们了解培 养基的制作原则和方法，掌握细菌的分离培养技术。 培养基是指在人工培养细菌时，提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制 品。基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源 和无机盐等。在基础培养基的基础上添加一些特殊成分（如糖类、血液、抑制剂 等）则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等。 (一)肉汤培养基 肉汤培养基是常用的液体培养基，也是制备常用的细菌分离培养基及其他某些培 养基的基础。 【材料】 鲜牛肉(去脂肪和肌腱)、蛋白胨、氯化钠、pH 试纸、10％碳酸氢钠、试管、三 角烧瓶、蒸馏水等。 【方法】 1．将新鲜牛肉 500g 切碎或搅碎，加水 1000ml，放 4℃冰箱或冷处浸泡过夜，然 后煮沸 30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为 原量。此溶液称为肉水或肉浸液。 2．1000ml 肉水中加入蛋白胨 10g、氯化钠 5g，加热溶解，放凉。 3．用精密 pH 试纸测酸碱度，用 10％碳酸氢钠校正 pH 为 7.2 左右。过碱时，可 用 10％醋酸校正之。 4．分装于试管中或三角烧瓶中，15 磅(121℃)高压蒸气灭菌 20～30min。 如用市售的牛肉膏代替新鲜肉水时，可将牛肉膏溶成 0.3～0.5％的水溶液，再如 上法制成培养基。 (二)普通琼脂培养基 普通琼脂培养基是常用的固体培养基，包括普通琼脂平板和普通琼脂斜面两种， 前者用于分离纯种细菌，后者用于增殖纯种细菌或保存菌种。 【材料】 ① 肉水 200ml
②蛋白胨2g ③氯化钠1g ④琼脂 ⑤无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等 【方法】 1.按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中,加热溶化。 2.趁热用pH试纸测酸碱度,用10%碳酸氢钠校正pH为72左右 3.15磅高压蒸气灭菌20~30min 4.趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内,每个平皿倒入约15m,凝固后即成普 通琼脂平板培养基;如趁热将培养基倒入灭菌试管内,再将试管斜放试验台上, 凝固后即成普通琼脂斜面培养基 琼脂系由海藻中提取的一种多糖,俗称洋粉,具有100℃溶化,40℃凝固的特性 细菌不能分解琼脂,故无营养作用,仅是固体培养基的赋形剂。 普通琼脂培养基也可用市售的营养琼脂粉(含有普通琼脂培养基的各种成分并已 调好pH)制备,用法见产品说明书。 (三)血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较髙,在普通琼脂培养基上生长不良,可用血液琼脂培养基 进行培养。 【材料】 ①普通琼脂培养基 200ml ②血液(脱纤维羊血或兔血) 10~20ml 【方法】 1.加热溶化普通琼脂培养基。 2.待冷至50℃左右时,加入无菌的脱纤维血液,混匀(注意勿使产生泡沫)。 3.分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。 质粒DNA的提取 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。作 为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒DNA上 携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA 重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主 细胞中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实验技能
② 蛋白胨 2g ③ 氯化钠 1g ④ 琼脂 5g ⑤ 无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等。 【方法】 1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中，加热溶化。 2．趁热用 pH 试纸测酸碱度，用 10％碳酸氢钠校正 pH 为 7.2 左右。 3．15 磅高压蒸气灭菌 20～30min。 4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约 15ml，凝固后即成普 通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上， 凝固后即成普通琼脂斜面培养基。 琼脂系由海藻中提取的一种多糖，俗称洋粉，具有 100℃溶化，40℃凝固的特性。 细菌不能分解琼脂，故无营养作用，仅是固体培养基的赋形剂。 普通琼脂培养基也可用市售的营养琼脂粉(含有普通琼脂培养基的各种成分并已 调好 pH)制备，用法见产品说明书。 (三)血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基 进行培养。 【材料】 ① 普通琼脂培养基 200ml ② 血液(脱纤维羊血或兔血) 10～20ml 【方法】 1．加热溶化普通琼脂培养基。 2．待冷至 50℃左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿使产生泡沫)。 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。 二、质粒 DNA 的提取 质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA，是进行 DNA 重组的常用载体。作 为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒 DNA 上 携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA 重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主 细胞中提取质粒 DNA，是 DNA 重组技术中最基础的实验技能
在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA 链发生断裂。所以,质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图分为:松弛线性的DNA 松弛开环的OC构型;超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙 锭,因此,在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的 SC DNA走在最前沿, OC DNA则位于凝胶的最后边;道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之 后产生的,它在凝胶中的位置介于 OC DNA和 SC DNA之间。以提取小量质粒 为例 )煮沸法 【原理】 煮沸法是根据 Holme和 Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程 中,DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA序列,在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方 面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度,DNA的纯度和甲基 化程度等。对DNA进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选 用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用 的缓冲液。DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性 琼脂糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度 的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色,可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要, 还可以从凝胶中回收DNA条带,用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要 比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长 度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA,可以通过电场方向 呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平 电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液( 般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受 分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。 【材料】 1.器材微量移液器(2oμl、200ul、1000ul),台式髙速离心机,恒温振荡 摇床,髙压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置 恒温水浴锅,1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管,离心管架
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒 DNA 链发生断裂。所以，质粒 DNA 琼脂塘凝胶电泳模式图分为：松弛线性的 DNA； 松弛开环的 OC 构型；超螺旋的 SC 构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙 锭，因此，在紫外线照射下 DNA 电泳带成橘黄色。道中的 SC DNA 走在最前沿， OC DNA 则位于凝胶的最后边；道中的 L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之 后产生的，它在凝胶中的位置介于 OC DNA 和 SC DNA 之间。以提取小量质粒 为例。 一）煮沸法 【原理】 煮沸法是根据 Holmex 和 Quigley（1985）的方法改进而成的。在基因工程 中，DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方 面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基 化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选 用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用 的缓冲液。DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度 的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要， 还可以从凝胶中回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要 比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长 度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA。长度 100kb 或更大的 DNA，可以通过电场方向 呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平 电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一 般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受 分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 【材料】 1. 器材 微量移液器（20μl、200μl、1000μl），台式高速离心机，恒温振荡 摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置， 恒温水浴锅，1.5ml 塑料离心管（又称 eppendorf 管），离心管架
2.菌种含卡那酶素的E. coli dh5a 3.试剂LB培养基,氨苄青霉素母液,溶菌酶溶液,3 mol naAc(pH5.2), 溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,RNA酶,A母液,饱和酚,氯仿,70%乙醇,无水 乙醇,异丙醇,T缓冲液,STET,STE,TBE缓冲液(5×),上样缓冲液(6 ),1%琼脂糖凝胶,DNA标准分子量标记物,溴化乙锭。 【方法】 1.细菌的培养和收集:将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50ug/ml Amp)中,37℃培养12-24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLB液体培养基 (含50 ug/ml Kan)中,37℃振荡培养约12h至对数生长后期。 2.裂解细菌 (1)无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管( Eppendorf管)中,微量 离心机上10000pm离心lmin,或者以4000pm离心5~10min,弃上清液,倒 扣于干净的吸水纸上吸干。 (2)将菌体沉淀悬浮于350μSTET缓冲溶液中,涡旋使其混匀。 (3)加入25山新配制的溶菌酶溶液(l0mg/m,用10 mmol/ Tris-CI(pH8.0) 配制),涡旋振荡大概3s。 (4)将 eppendorf管放入沸水浴中,40s后立即取出 (5)微量离心机上以4℃,12000mp离心10min。用无菌牙签从 eppendorf 管中挑去细菌碎片。 (6)在上清液中加入40μ5mol乙酸钠(pH5.2)和420山l异丙醇,振荡 混匀,于室温放置5min。 (7)微量离心机上以4℃,12000mp离心5min,回收核酸沉淀。小心吸 去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液 滴除尽。 (8)加入1m70%乙醇,以4℃,12000rmp离心2min。轻轻地吸去上清 液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成的所有乙醇 液滴,室温下放置,直至乙醇挥发完全,管内无可见的液体为止(大概需要 2~5min)。 (9)用50l无DNA酶的胰RNA酶(2oμg/ml)的TE(pH8:0)溶解核酸, 稍加振荡即可,贮存于-20℃ 3.分离和纯化质粒DNA
2. 菌种 含卡那酶素的 E. coli DH5α。 3. 试剂 LB 培养基，氨苄青霉素母液，溶菌酶溶液，3mol/l NaAc (pH5.2)， 溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNA 酶，A 母液，饱和酚，氯仿，70%乙醇，无水 乙醇，异丙醇，TE 缓冲液，STET，STE，TBE 缓冲液 (5×)，上样缓冲液（6 ×），1%琼脂糖凝胶，DNA 标准分子量标记物，溴化乙锭。 【方法】 1. 细菌的培养和收集 ：将含有质粒菌种接种在 LB 固体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37℃培养 12~24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基 （含 50μg/ml Kan）中，37℃振荡培养约 12h 至对数生长后期。 2. 裂解细菌 （1）无菌操作台上取 1.5ml 培养菌体置于离心管（Eppendorf 管）中，微量 离心机上 10 000rpm 离心 1min，或者以 4000rpm 离心 5~10min，弃上清液，倒 扣于干净的吸水纸上吸干。 （2）将菌体沉淀悬浮于 350μl STET 缓冲溶液中，涡旋使其混匀。 （3）加入 25μl 新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml，用 10mmol/L Tris-Cl（pH8.0） 配制），涡旋振荡大概 3s。 （4）将 eppendorf 管放入沸水浴中，40s 后立即取出。 （5）微量离心机上以 4℃，12 000rmp 离心 10min。用无菌牙签从 eppendorf 管中挑去细菌碎片。 （6）在上清液中加入 40μl 5mol/L 乙酸钠（pH5.2）和 420μl 异丙醇，振荡 混匀，于室温放置５min。 （7）微量离心机上以 4℃，12 000rmp 离心 5min，回收核酸沉淀。小心吸 去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液 滴除尽。 （8）加入 1ml 70％乙醇，以 4℃，12 000rmp 离心 2min。轻轻地吸去上清 液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇 液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止（大概需要 2~5min）。 （9）用 50μl 无 DNA 酶的胰 RNA 酶（20μg/ml）的 TE（pH8.0）溶解核酸， 稍加振荡即可，贮存于-20℃。 3. 分离和纯化质粒 DNA
(1)配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶,加入100 ml tBe缓冲液,称 取lg琼脂糖加入缓冲液中,沸水浴加热至完全溶解,然后在55℃水浴中保温 在灌胶模具中插入梳齿,将稍微冷却的凝胶倒λ灌胶模具。凝胶厚度3~5mm, 避免气泡产生。 (2)室温放置30~45min,待凝胶完全凝固后,按照厂家说明将凝胶放入水 平板电泳槽。 (3)在电泳槽中加入电泳缓冲液,电泳缓冲液没过胶面1mm,拔下梳齿形 成样品池。 (4)取样品与6×样品缓冲液按照比例混合后,用微量移液器缓慢加入样 品池中。 (5)盖上电泳槽并且通电,注意电源正负极,确保样品向阳极移动。恒压 l~-sv/cm(按照两极之间距离计算),至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端lcm 时,切断电源 (6)从电泳槽中取出凝胶,将凝胶置于0.5ugml溴化乙啶水溶液中,室温 下振摇染色30~45mn (7)回收染色液,自来水冲洗凝胶后,于紫外灯下观察。 【注意事项】 1.大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 添加溶菌酶一定要有限度,浓度过髙细菌裂解效果反而不好,有时不同 溶菌酶也能溶菌。提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实 验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。试验步骤中的细菌沉淀和核酸 沉淀中去除上清液时,一定要除尽 3.用π0%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎,防止将核酸同洗液 起倒掉。实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 4!.当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA株,如HBl01)中小量制 粒DNA时,建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,在 Mg2存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。若要避免这一问题 可以在用70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。 5.如果要通过限酶切割反应来分析DNA,可取1 HI dNA溶液加到另一个含 8μl水的微量离心管内,加lu10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜
（1）配制 1%琼脂糖凝胶。取 250ml 三角瓶，加入 100ml TBE 缓冲液，称 取 1g 琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在 55℃水浴中保温。 在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度 3~5mm， 避免气泡产生。 （2）室温放置 30~45min，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水 平板电泳槽。 （3）在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面 1mm，拔下梳齿形 成样品池。 （4）取样品与 6×样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样 品池中。 （5）盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压 1~5V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端 1cm 时，切断电源。 （6）从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于 0.5ug/ml 溴化乙啶水溶液中，室温 下振摇染色 30~45min。 （7）回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 【注意事项】 1. 大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 2. 添加溶菌酶一定要有限度，浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同 溶菌酶也能溶菌。提取的质粒 DNA 中会含有 RNA，但 RNA 并不干扰进一步实 验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。试验步骤中的细菌沉淀和核酸 沉淀中去除上清液时，一定要除尽。 3. 用 70%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液 一起倒掉。 实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 4. 当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌株（endA+株，如 HB101）中小量制 粒 DNA 时，建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，在 Mg2+存在下温育（V 中用限制酶时）质粒 DNA 可被降解。 若要避免这一问题 可以在用 70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。 5. 如果要通过限酶切割反应来分析 DNA，可取 1μl DNA 溶液加到另一个含 8μl 水的微量离心管内，加 1μl 10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜