基础验证性实验 实验一细菌基本形态的观察 由于细菌个体微小,需借助显微镜,才能够看清细菌的形状、大小、结构、排列及染色 特性等。因此,同学们首先要熟练掌握油镜的使用及保护。 、显微镜油镜头的使用及保护 【使用原理】 显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。油镜的透镜很小,光线通过玻片与油 镜头之间的空气时,因介质密度不同,发生折射或全反射,使射入透镜的光线减少,物象显 现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率相近的香柏油和液体石蜡,避免光线散射, 使进入透镜的光线增多,视野亮度增强,观察物象更加清楚 3 1、光线C、D、C’、D’通过载玻片经香柏油 折射,使进入物镜中的光线量较多。 2、光线A、B、A'、B’通过载玻片经空气折 射,使进入物镜中的光线量减少 图1-1油镜的使用原理 【操作方法】 1.物镜的放大率可由其外形辨认,镜头长度越大,镜片直径越小,放大倍数越大;反之, 放大倍数越小。油镜头长度大于低、高倍镜,镜头下缘一般刻有一圈黑线、白线或蓝线,并 刻有100×或oil等字样。 2.使用显微镜油镜时,必须将显微镜端正直立桌上,不得将镜臂弯曲,以免使载物台倾 斜,松柏油流溢,影响观察,污染台面。 3.调试:打开电源,先采用低倍镜,上下移动集光器和光圈,使视野达到清晰光亮。将 标本片固定于载物台上,镜头对准标本面,先用低倍镜找出标本的位置,转动粗螺旋使镜筒 上升,在标本的待检部位滴加一滴香柏油,改换油镜头观察。 4.调焦距 (Ⅰ)转动粗螺旋使载物台徐徐上升,同时眼睛从右侧观察镜筒下降程度,至油镜头浸入 油中。小心操作,以免压碎标本片或损坏镜头。 (2)用双眼观察目镜,反方冋缓慢地转动粗螺旋,下降载物台,待看到模糊物象时,换 用细螺旋,转动至物象完全清晰为止
3 基础验证性实验 实验一 细菌基本形态的观察 由于细菌个体微小，需借助显微镜，才能够看清细菌的形状、大小、结构、排列及染色 特性等。因此，同学们首先要熟练掌握油镜的使用及保护。 一、显微镜油镜头的使用及保护 【使用原理】 显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。油镜的透镜很小，光线通过玻片与油 镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显 现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率相近的香柏油和液体石蜡，避免光线散射， 使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，观察物象更加清楚。 图 1-1 油镜的使用原理 【操作方法】 1.物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数越大；反之， 放大倍数越小。油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线、白线或蓝线，并 刻有 100×或 oil 等字样。 2.使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，以免使载物台倾 斜，松柏油流溢，影响观察，污染台面。 3.调试：打开电源，先采用低倍镜，上下移动集光器和光圈，使视野达到清晰光亮。将 标本片固定于载物台上，镜头对准标本面，先用低倍镜找出标本的位置，转动粗螺旋使镜筒 上升，在标本的待检部位滴加一滴香柏油，改换油镜头观察。 4.调焦距： ⑴ 转动粗螺旋使载物台徐徐上升，同时眼睛从右侧观察镜筒下降程度，至油镜头浸入 油中。小心操作，以免压碎标本片或损坏镜头。 ⑵ 用双眼观察目镜，反方向缓慢地转动粗螺旋，下降载物台，待看到模糊物象时，换 用细螺旋，转动至物象完全清晰为止。 1、光线 C、D、C’、D’通过载玻片经香柏油 折射，使进入物镜中的光线量较多。 2、光线 A、B、A’、B’通过载玻片经空气折 射，使进入物镜中的光线量减少
(3)观察时只用细螺旋调节,需改换视野时,右手操纵推进器,左手转动细螺旋,做到 配合自如。并养成左眼观察,右眼绘图的习惯 (4)实验完毕,先提髙镜筒,并将油镜头扭向一侧,再取下标本片。油镜头使用后须用 擦镜纸滴加适量酒精和乙醚混合液(η:3)将镜头上的油擦洗干浄。不用时将物镜转成“八” 字形,载物台降至低点,下降集光器,关上光圈,套上保护罩,双手平托放回原处 镜 镜臂 镜台 光源 聚光镜 图1-2普通光学显微镜结构图 【油镜头的保护】 1显微镜是精密仪器,使用时要注意爱护,切勿随意拆卸和碰撞。 2.强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件,均需注意不使其接触显微镜。 3细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分,每旋转一周使镜筒上升或下降0.1毫 米,只能往返回转,即向一个方向转动数周,遇阻力时,应反方向转动 4显微镜不用时放入镜柜,避免直射日光,置于干燥处,以防受潮。 【注意事项】 1.显微镜使用时,如发现问题或配件短缺应及时向老师报告并进行登记,以便检修 2观察不染色标本时,需下降集光器并适当地缩小光圈,使光度减弱:观察染色标本时 光度宜强,应将显微镜亮度开关调至最亮,光圈完全打开,并上升集光器至与载物台相平 3.使用直筒显微镜观察标本时,必须两眼同时睁开,训练使用左眼观察,右眼绘图 如用油镜头观察,勿将镜身歪斜,避免镜油流出片面。 4.使用完毕,勿必擦去镜头油, 二、细菌基本形态观察(示教) 1.球形:葡萄球菌G—一菌体正圆形,染成蓝紫色,呈现葡萄串状排列。Gˉ球菌
4 ⑶ 观察时只用细螺旋调节，需改换视野时，右手操纵推进器，左手转动细螺旋，做到 配合自如。并养成左眼观察，右眼绘图的习惯。 ⑷ 实验完毕，先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后须用 擦镜纸滴加适量酒精和乙醚混合液（7：3）将镜头上的油擦洗干净。不用时将物镜转成“八” 字形，载物台降至低点，下降集光器，关上光圈，套上保护罩，双手平托放回原处。 图 1-2 普通光学显微镜结构图 【油镜头的保护】 1.显微镜是精密仪器，使用时要注意爱护，切勿随意拆卸和碰撞。 2.强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件，均需注意不使其接触显微镜。 3.细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或下降 0.1 毫 米，只能往返回转，即向一个方向转动数周，遇阻力时，应反方向转动。 4.显微镜不用时放入镜柜，避免直射日光，置于干燥处，以防受潮。 【注意事项】 1.显微镜使用时，如发现问题或配件短缺应及时向老师报告并进行登记，以便检修。 2.观察不染色标本时，需下降集光器并适当地缩小光圈，使光度减弱；观察染色标本时， 光度宜强，应将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，并上升集光器至与载物台相平。 3. 使用直筒显微镜观察标本时，必须两眼同时睁开，训练使用左眼观察，右眼绘图。 如用油镜头观察，勿将镜身歪斜，避免镜油流出片面。 4. 使用完毕，勿必擦去镜头油。 二、细菌基本形态观察（示教） 1. 球形：葡萄球菌G ＋——菌体正圆形，染成蓝紫色，呈现葡萄串状排列。G+球菌
2.杆形:大肠杆菌Gˉ——菌体短杆状,染成红色,呈不规则分散排列。G杆菌 3.螺形:霍乱弧菌Gˉ—一菌体弧形,染成红色,呈不规则分散排列。G弧菌。 革兰染色法(操作) 细菌革兰染色有助于鉴别细菌 【原理】 细菌的等电点较低,约在pH2~5之间,故在中性、碱性或弱碱性溶液中,菌体蛋白质电 离后带负电荷,易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合,使细菌被染成紫色或 红色。革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法,籍此染色法,可将所有细菌区分为 两大类。 【材料】 1.葡萄球菌、大肠杄菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。 2.革兰染色液。 3.生理盐水,载物玻片,接种环等。 【方法】 1.制片: )灭菌:接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌(图1-3),直至金属丝烧红,然 后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌,重复三次 2)涂片 ①取清洁无油污载物玻片一张,已灭菌接种环沾取生理盐水1-2环置于玻片中央。 ②用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持菌种的试管盖,并立即火焰烧灼试管口灭 ③再用已灭菌冷却接种环伸入试管中,沾取少许葡萄球菌或大肠杄菌菌苔,混于生理盐 水中,轻轻涂成均匀薄膜。 ④再次灭菌试管口,盖好试管,放回原处。 ⑤然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境,接种环灭菌前,须先将接 种环靠近火焰或放内焰中烤干,然后再在外焰中娆红灭菌,杀死残留的细菌。(若菌种为脓 液、痰液等液体标本,注意取菌液时(图1-4)勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口 3)干燥:最好在室温自然干燥,如需加速干燥,也可将涂面向上,远离火焰上方微加温 干燥(离火焰20cm处,切勿加热过度,以防将标本烧枯) 4)固定:标本干燥后,用加热固定法固定。常玻片有菌膜的面向上,在火焰的最热部 分通过酒精灯火焰三次(约2~3秒钟),固定的目的是杀死细菌使之固定于玻片上,并使细 菌蛋白变性,以改变菌体对染料的通透性 2.染色:根据不同的染色要求使用相应染色液进行染色。 ①初染:于涂抹面上滴加结晶紫染液1~2滴,覆盖涂面,室温染色一分钟。用细流水冲 洗剩留染液,甩去片上积水 ②媒染:滴加卢戈碘液,室温作用一分钟,细流水冲洗,甩去积水 ③脱色:将载玻片浸于95%酒精缸中,上下提取,边提边看,直至涂面流下的液体无 色为止(约30秒钟)。细流水冲洗,甩去积水
5 2. 杆形：大肠杆菌G －——菌体短杆状，染成红色，呈不规则分散排列。G-杆菌。 3. 螺形：霍乱弧菌G －——菌体弧形，染成红色，呈不规则分散排列。G-弧菌。 三、革兰染色法（操作） 细菌革兰染色有助于鉴别细菌。 【原理】 细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电 离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或 红色。革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法，籍此染色法，可将所有细菌区分为 两大类。 【材料】 1. 葡萄球菌、大肠杆菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。 2. 革兰染色液。 3. 生理盐水，载物玻片，接种环等。 【方法】 1．制片： 1）灭菌：接种环以 15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌(图 1-3)，直至金属丝烧红，然 后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌，重复三次。 2） 涂片： ①取清洁无油污载物玻片一张，已灭菌接种环沾取生理盐水 1~2 环置于玻片中央。 ②用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持菌种的试管盖，并立即火焰烧灼试管口灭 菌。 ③再用已灭菌冷却接种环伸入试管中，沾取少许葡萄球菌或大肠杆菌菌苔，混于生理盐 水中，轻轻涂成均匀薄膜。 ④再次灭菌试管口，盖好试管，放回原处。 ⑤然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接 种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。（若菌种为脓 液、痰液等液体标本，注意取菌液时(图 1-4)勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。 3）干燥：最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将涂面向上，远离火焰上方微加温 干燥（离火焰20㎝处，切勿加热过度，以防将标本烧枯）。 4）固定：标本干燥后，用加热固定法固定。常玻片有菌膜的面向上，在火焰的最热部 分通过酒精灯火焰三次（约 2~3 秒钟），固定的目的是杀死细菌使之固定于玻片上，并使细 菌蛋白变性，以改变菌体对染料的通透性。 2. 染色：根据不同的染色要求使用相应染色液进行染色。 ①初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液1～2滴，覆盖涂面，室温染色一分钟。用细流水冲 洗剩留染液，甩去片上积水。 ②媒染：滴加卢戈碘液，室温作用一分钟，细流水冲洗，甩去积水。 ③脱色：将载玻片浸于 95%酒精缸中，上下提取，边提边看，直至涂面流下的液体无 色为止（约 30 秒钟）。细流水冲洗，甩去积水
外焰 内焰 图1-3接种环灭菌 图1-4试管中取菌 ④复染:加稀释石炭酸复红染液1~2滴,染色30秒钟,细流水冲洗,吸水纸吸干玻片水 3.油镜检查 【结果】染色片待干后,于油镜下,调强光视野观察,呈紫色的为革兰阳性菌,呈红色 的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色,为革兰阳性,以G表示:大肠杆菌染成红色,为革 阴性,以G表示 【注意事项】 1.脱色是革兰染色中的关键步骤,脱色过度,可使Gˉ菌被误染为G菌;脱色不够 则G菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关,一般以涂片薄而均匀为好。 2.G菌与G菌的染色反应,还受多种因素如菌龄、染色时间、pH等的影响,只有严 格正规操作,才能得到正确结果。 【附注】 与医学有关的常见细菌的革兰染色性:见下页。 2.革兰(Gram)染色液的配制 (1)结晶紫染液 ①结晶紫酒精饱和液:取14g结晶紫溶于100m195%的酒精内 ②1%草酸铵水溶液:草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水中。 ③将已配好之①液20m和②液80ml混合即成,置瓶中备用。 (2)芦戈( Lugol)氏碘液 ①碘lg:碘化钾2g:蒸馏水300ml ②先将碘化钾2g溶于10om蒸馏水中,再加碘1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 30oml即成。供革兰染色媒染用 (3)95%酒精 (4)石炭酸复红稀释液 1份碱性复红饱和液(碱性复红32克溶于95%酒精100m中。即为碱性复红饱和溶液) 加9份5%石炭酸水溶液,先配成石炭酸复红染液(抗酸染色用),取1份石炭酸复红染液 加9份蒸馏水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后,均需用滤纸过滤后使用,染液应贮
6 ④复染：加稀释石炭酸复红染液1～2滴，染色30秒钟，细流水冲洗，吸水纸吸干玻片水 分。 3. 油镜检查 【结果】染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色 的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以 G+表示；大肠杆菌染成红色，为革 兰阴性，以 G-表示。 【注意事项】 1. 脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度，可使 G+菌被误染为 G- 菌；脱色不够， 则 G- 菌可被误染为 G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。 2. G+菌与 G- 菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH 等的影响，只有严 格正规操作，才能得到正确结果。 【附注】 1. 与医学有关的常见细菌的革兰染色性：见下页。 2. 革兰（Gram）染色液的配制 （1）结晶紫染液 ① 结晶紫酒精饱和液：取 14g 结晶紫溶于 100ml 95％的酒精内。 ② １%草酸铵水溶液：草酸铵 0.8g 溶于 80ml 蒸馏水中。 ③ 将已配好之①液 20ml 和②液 80ml 混合即成，置瓶中备用。 （2）芦戈（Lugol）氏碘液 ① 碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水 300ml ② 先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 300ml 即成。供革兰染色媒染用。 （3）95％酒精 （4）石炭酸复红稀释液 1 份碱性复红饱和液（碱性复红 3.2 克溶于 95%酒精 100ml 中。即为碱性复红饱和溶液） 加 9 份 5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取 1 份石炭酸复红染液 加 9 份蒸馏水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮 图 1-3 接种环灭菌 图 1-4 试管中取菌
存于棕色瓶内。 葡萄球菌、链球菌、四联球菌 八叠球菌、肺炎链球菌等 枯草杆菌 需氢芽胆杆菌 革兰氏阳性菌 炭疽杆菌 有芽胞菌 破伤风授菌 厌氧芽胞梭菌{气英棱菌 杆菌 肉毒校菌 白 喉杆菌 芽胞菌 结核杆菌 脑膜炎球菌 淋球菌 大肠杆菌、痢疾杄菌、变形杆菌 革兰氏阴性菌 肠道杆菌{沙门氏菌属:食物中毒沙门氏菌 杆菌 伤寒杆菌、副伤寒杆菌 非肠道杆菌:百日咳杆菌、鼠疫杆菌 霾乱及副霍乱弧菌 实验二细菌特殊结构的染色和观察 特殊结构 1.鞭毛:伤寒杆菌一一菌体较粗大杆状,染成蓝灰色,单个或成堆存在,周围可见到 波浪状弯曲、较长、呈蓝灰色的鞭毛。 2.荚膜:肺炎双球菌一一视野背景为红色,其中可见到染色呈深红色,矛头状菌体 纵向成双排列,菌体周围有未染上颜色的空白区,即荚膜 3.芽胞:破伤风梭菌一一菌体为细长杆状,顶端有染成蓝色、并大于菌体的球状物即 芽胞,呈“鼓槌状”,其它散乱分布的菌体,为菌体脱落的成熟芽胞 、细菌的芽胞染色 【目的】掌握细菌的芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能 使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而 旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着 色力强的染料外,还需要加热,以促进芽胞着色。当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗, 芽胞染上的颜色难以渗出,而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽 胞呈现出不同的颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察
7 存于棕色瓶内。 实验二 细菌特殊结构的染色和观察 一、特殊结构 1. 鞭毛：伤寒杆菌——菌体较粗大杆状，染成蓝灰色，单个或成堆存在，周围可见到 波浪状弯曲、较长、呈蓝灰色的鞭毛。 2．荚膜：肺炎双球菌——视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，矛头状菌体， 纵向成双排列，菌体周围有未染上颜色的空白区，即荚膜。 3. 芽胞：破伤风梭菌——菌体为细长杆状，顶端有染成蓝色、并大于菌体的球状物即 芽胞，呈“鼓槌状”，其它散乱分布的菌体，为菌体脱落的成熟芽胞。 二、细菌的芽胞染色 【目的】 掌握细菌的芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能 使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一 旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着 色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗， 芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽 胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察