实验方法 二组织中总RNA的提取及RT-PCR 步骤(略) RNA浓度的测定(略) 心对照设置:(1)阴性对照:以去离子水代替提取 的总RNA,结果阴性。 (2)内参对照:用β actin作为内参引物,与 EphA2和KAI1引物分别同管扩增,结果在紫外灯下 出现一条330bp的荧光带 结果判定 心阳性判断标准为:目的EphA2基因 RT-PCR产物凝 胶电泳后在紫外灯下分别出现一条586bp的荧光带
二 .组织中总RNA的提取及RT-PCR ❖步骤 （略） ❖ RNA浓度的测定 （略） ❖对照设置 ：（1）阴性对照：以去离子水代替提取 的总RNA，结果阴性。 ❖（2）内参对照：用β-actin作为内参引物，与 EphA2和KAI1引物分别同管扩增，结果在紫外灯下 出现一条330bp的荧光带 ❖结果判定 ❖阳性判断标准为：目的EphA2基因RT-PCR产物凝 胶电泳后在紫外灯下分别出现一条586bp的荧光带 。 实 验 方 法
FCM实验步骤: 取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g 上机检测 剪碎100、300目尼龙网上搓 Stain1m避光30min 收集细胞液,800 prm/min离心2min 70%乙醇(4°C中固定1h LPR染液,避光冷藏(4°C5min
取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g 剪碎100、300目尼龙网上搓 收集细胞液，800prm/min离心2min 70%乙醇(4℃)中固定1h LPR染液,避光冷藏(4℃)5min Stain 1ml避光30min. 上机检测 FCM实验步骤：
FCM对照组设计和诊断标准: 设正常对照组:用正常人外周血淋巴细胞,即二倍体细胞作为DNA含量 和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 DNA倍体分析:用 Partec流式细胞仪,计数10000个细胞,具有相同DNA含 量的细胞群表现为直方图中独立的峰即每个峰表示一定DNA含量或倍体 ·的细胞亚群。在正常对照组中第1个峰代表单倍体(2C)细胞亚群,在实验 ·组中,第1个峰代表双倍体(GoG1,2C)细胞亚群第3个峰则代表四倍体 (G2/M,4C)细胞亚群,两峰之间代表S期细胞亚群。计算机系统算出每 ·个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比 诊断标准根据左连富的标准,DNA倍体单倍体细胞百分数与正常对照组 单倍体细胞平均百分数相比较在其两个标准差之内为正常,否则为异常
FCM对照组设计和诊断标准： • 设正常对照组：用正常人外周血淋巴细胞，即二倍体细胞作为DNA含量 • 和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 • DNA倍体分析:用Partec流式细胞仪,计数10000个细胞,具有相同DNA含 • 量的细胞群表现为直方图中独立的峰,即每个峰表示一定DNA含量或倍体 • 的细胞亚群。在正常对照组中,第1个峰代表单倍体(2C)细胞亚群,在实验 • 组中，第1个峰代表双倍体(G0/G1 ,2C)细胞亚群,第3个峰则代表四倍体 • (G2/M，4C)细胞亚群，两峰之间代表S期细胞亚群。计算机系统算出每 • 个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比。 • 诊断标准:根据左连富的标准,DNA倍体单倍体细胞百分数与正常对照组 • 单倍体细胞平均百分数相比较,在其两个标准差之内为正常,否则为异常
FCM计算标准: DNA指数(DI)计算公式:DⅠ=样品细胞Gl峰道数均值÷正常 组织细胞Gl峰道数均值。 DNA含量分析以DNA指数(D)表示细胞DNA相对含量,根 据D值判断DNA倍体。0.9<D1<1.1为DNA二倍体;D1<0.9 或>1.1为异倍体 细胞周期分布的计算:运用DNA细胞分析软件,计算出各时 相的分布百分比,以S期细胞比率(SPF)和增殖指数(PI表 示细胞的增殖活性。 SPF(%)=[S÷(G0/G1+S+G2M)]×100% PI=(S+G2)÷(G1+S+G2)]×100%
FCM计算标准： • DNA指数(DI)计算公式：DI=样品细胞G1峰道数均值÷正常 组织细胞G1峰道数均值。 • DNA含量分析:以DNA指数(DI)表示细胞DNA相对含量，根 据DI值判断DNA倍体。0.9≤DI ≤1. 1 为DNA二倍体;DI < 0. 9 或> 1. 1 为异倍体。 • 细胞周期分布的计算：运用DNA细胞分析软件，计算出各时 相的分布百分比，以S期细胞比率(SPF)和增殖指数（PI）表 示细胞的增殖活性。 • SPF( %) = [ S ÷( G0/ G1 + S + G2M) ] ×100 % • PI=[(S+G2)÷（G1+S+G2）]×100%
统计学处理 所有数据均经SPSS120软件进行统计分析。计数资 料计算阳性率,计量资料用采用X士S表示;阳性率 之间的比较采用x2检验( chi-square)及 Fisheri确定概 率计算法;两组均数的比较用t检验 (t-test);两组以 上均数的比较用方差分析( anOA)和 Spearman 等级相关分析;两变量之间的关系分析采用相关分 析;多变量之间的关系分析采用秩和Chi- sguare检 验;行程列表 Chi-sguare检验。显著性水准cα=0.05
统计学处理 所有数据均经SPSS 12.0软件进行统计分析。计数资 料计算阳性率，计量资料用采用X±S表示；阳性率 之间的比较采用χ 2检验（chi-square）及Fisher确定概 率计算法；两组均数的比较用t检验(t-test)；两组以 上均数的比较用方差分析（ANVOA）和 Spearman 等级相关分析；两变量之间的关系分析采用相关分 析；多变量之间的关系分析采用秩和Chi-sguare 检 验；行程列表Chi-sguare检验。显著性水准α=0.05