实验一普通光学显微镜 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成,而当前使用的显微镜 由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500--2000倍。 (一)显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分:一为机械装置,一为光学系统,这两部分很好的配合,才能发挥显 微镜的作用 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件 (1)镜座镜座是显微镜的基本支架,它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒,它是 用来安装光学放大系统部件的基础。 2)镜筒镜筒上接接目镜,下接转换器,形成接目镜与接物镜(装在转换器下)间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒 长度的变化,不仅放大倍率随之变化,而且成像质量也受到影响。因此,使用显微镜时,不能任意改变镜筒 长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm,此数字标在物镜的外壳上 3)物镜转换器物镜转换器上可安装3一4个接物镜,一般是三个接物镜(低倍、高倍、油镜)。 Nikon 显微镜装有四个物镜。转动转换器,可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通,与镜筒上面的接目镜 构成一个放大系统 (4)载物台载物台中央有一孔,为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器,其作用为固定或移动标 本的位置,使得镜检对象恰好位于视野中心 5)推动器是移动标本的机械装置,它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的,好的显微镜在纵横 架杆上刻有刻度标尺,构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分,在第一次检 查时,可记下纵横标尺的数值,以后按数值移动推动器,就可以找到原来标本的位置 (6)粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件,老式显微镜粗螺旋向前扭,镜头下 降接近标本。新近出产的显微镜(如 Nikon显微镜)镜检时,右手向前扭载物台上升,让标本接近物镜,反 之则下降,标本脱离物镜 〔⑦)微动螺旋用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距,要得到最清晰的物象,需要用微动螺旋做进一步调节 微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米(100微米)。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是 共轴的。 2、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜,聚光器,接物镜,接目镜等组成,光学系统使物体放大,形成物体放大 像。见图1-2。 (1)反光镜较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体,在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另 凹面的镜子组成,可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央,照明标本。不用聚光器时用凹面 镜,凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时,一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有 光源,并有电流调节螺旋,可通过调节电流大小调节光照强度。 (2)豪光器聚光器在载物台下面,它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场 聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器,明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光 器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和 慧差的校正程度很高,是明视场镜检中质量最好的聚光器,但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚 光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜(4×)大视场照明的需要 聚光器安装在载物台下,其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上,以得到最强的照明 使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节,使焦点落在被检物体上,以得到最大亮度。一般聚光 器的焦点在其上方1.25mm处,而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此,要求使用的载玻片厚度应在 0.8-1.2mm之间,否则被检样品不在焦点上,影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈,它可以
实验一 普通光学显微镜 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜 由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大 1500—2000 倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显 微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件 （1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是 用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒 长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒 长度。国际上将显微镜的标准筒长定为 160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器 物镜转换器上可安装 3—4 个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon 显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜 构成一个放大系统。 （4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标 本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横 架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检 查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。 （6）粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下 降接近标本。新近出产的显微镜（如 Nikon 显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反 之则下降，标本脱离物镜。 （7）微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。 微动螺旋每转一圈镜筒移动 0.1 毫米（100 微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是 共轴的。 2、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大 像 。见图 1—2。 （1）反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另 一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面 镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有 光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。 （2）聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场 聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光 器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于 0.6 时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和 慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于 4 倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚 光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明的需要。 聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明， 使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光 器的焦点在其上方 1.25mm 处，而其上升限度为载物台平面下方 0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在 0.8—1.2mm 之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以
开大和缩小,影响着成像的分辨力和反差,若将虹彩光圈开放过大,超过物镜的数值孔径时,便产生光斑 若收缩虹彩光圈过小,分辨力下降,反差增大。因此,在观察时,通过虹彩光圈的调节再把视场光阑(带有 视场光阑的显微镜)开启到视场周缘的外切处,使不在视场内的物体得不到任何光线的照明,以避免散射光 的干扰 3〕物镜安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像,物镜成像的质量,对分 辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径( numerical apeature简写为NA),每个物镜 的数值孔径都标在物镜的外壳上,数值孔径越大,物镜的性能越好。 物镜的种类很多,可从不同角度来分类 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同,可分为: ①干燥系物镜以空气为介质,如常用的40×以下的物镜,数值孔径均小于1。 ②油浸系物镜常以香柏油为介质,此物镜又叫油镜头,其放大率为90×—100×,数值孔值大于1。 根据物镜放大率的高低,可分为 ①低倍物镜指1×-6×,NA值为0.04-0.15 中倍物镜指6×-25×,NA值为0.15-0.40 ③高倍物镜指25×-63×,NA值为0.35-0.95; ④油浸物镜指90×-100×,NA值为1.25-1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为: ①消色差物镜是最常用的物镜,外壳上标有“Ach”字样,该物镜可以除红光和青光形成的色差 镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜物镜外壳上标有“Apo”字样,除能校正红、蓝、绿三色光的色差外,还能校正黄 色光造成的相差,通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜在上述物镜基础上,为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如:带校正环物镜,带视 场光阑物镜,相差物镜,荧光物镜,无应变物镜,无罩物镜,长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜 还有:半复消色差物镜(FL),平场物镜(Plan),平场复消色差物镜( Plan apo),超平场物镜( Splan, 平场复消色差物镜( Splan apo)等 (4)目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次,并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物 镜简单,普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成,上端的一块透镜称“接目镜”,下端的透镜称“场镜” 上下透镜之间或在两个透镜的下方,装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”,物镜放大后的中间像就落 在视场光阑平面处,所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜( Huygens eyepiece),如要进行研究用时,一般选用性能 更好的目镜,如补偿目镜(K)、平场目镜(P)、广视场目镜(WF)。照相时选用照相目镜(NFK)。 (二)光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的,单透镜成像具有像差,影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于 个凸透镜,放大作用更好。图1—4是显微镜的成像原理模式。AB为标本 (三)显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高,而且清晰,物体放大 后,能否呈现清晰的细微结构,首先取决于物镜的性能,其次为目镜和聚光镜的性能 1、数值孔径也叫做镜口率(或开口率),简写为N.A,在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径,数值孔 径是物镜和聚光器的主要参数,也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关 系,它与显微镜的分辨力成正比,与焦深成反比,与镜象亮度的平方根成正比 数值孔径可用下式表示: N. A=n. sin 式中: n一物镜与标本之间的介质析射率
开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑； 若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有 视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光 的干扰。 （3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分 辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature 简写为 NA），每个物镜 的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。 物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜 以空气为介质，如常用的 40×以下的物镜，数值孔径均小于 1。 ②油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为 90×—100×，数值孔值大于 1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜 指 1×—6×，NA 值为 0.04—0.15； ②中倍物镜 指 6×—25×，NA 值为 0.15— 0.40； ③高倍物镜 指 25×—63×，NA 值为 0.35—0.95； ④油浸物镜 指 90×—100×，NA 值为 1.25—1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。 镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄 色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视 场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜 还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（Plan Apo）,超平场物镜（Splan，超 平场复消色差物镜（Splan Apo）等。 （4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物 镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。 上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落 在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如要进行研究用时，一般选用性能 更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。 （二）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一 个凸透镜，放大作用更好。图 1—4 是显微镜的成像原理模式。AB 为标本 （三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大 后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。 1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为 N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔 径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关 系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。 数值孔径可用下式表示： N.A=n.sin α 2 式中： n—物镜与标本之间的介质析射率
a一物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度,见图1 镜口角a总是小于180°。因为空气的折射率为1,所以干燥物镜的数值孔径总是小于1,一般为0.05 0.95:油浸物镜如用香柏油(折射率为1.515)浸没,则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径 的极限等于所用浸没介质的折射率,但实际上从透镜的制造技术看,是不可能达到这一极限的。通常在实用 范围内,高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4 几种物质的介质的折射率如下 空气为1.0,水为1.33,玻璃为1.5,甘油为1.47,香柏油为1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图1-6。 2、分辨力 D可用下式表示: λ/2N.A 可见光的波长为0.4-0.7微米,平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜,则D=0.55微米 /2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到,若小于0.42微米就不能视见。如果 使用数值孔径为1.25的物镜,则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值,均能视见。由此可见,D值 愈小,分辨力愈高,物象愈清楚。根据上式,可通过:(1)减低波长:(2)增大折射率:(3)加大镜口 角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的 物镜分辨力的高低与造象是否淸楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3、放大率 显微镜放大物体,首先经过物镜第一次放大造象,目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最 后的象和原物体两者体积大小之比例。因此,显微镜的放大率(V)等于物镜放大率(V1)和目镜放大率(V2) 的乘积,即 V=V1×V2 比较精确的计算方法,可从下列公式求得 F1=接物镜焦距,F2=接目镜焦距△=光学筒长,D=明视距离(=250毫米) 接物镜的放大倍 =接目镜放大倍 M=显微镜放大倍 数 数 数 设△=160毫米F=4毫米D=250毫米F2=150毫米 60 =40×16.7=668 5 4、焦深: 在显微镜下观察一个标本时,焦点对在某一象面时,物象最清晰,这象面为目的面。在视野内除目的 面外,还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象,这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径 及放大率成反比:即数值孔径和放大率愈大,焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细,否则容易 使物象滑过而找不到 二、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密,使用时必须细心,要按下述操作步骤进行
α—物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，见图 1— 5。 镜口角α总是小于 180°。因为空气的折射率为 1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于 1，一般为 0.05 —0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为 1.515）浸没，则数值孔径最大可接近 1.5。虽然理论上数值孔径 的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用 范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是 1.4。 几种物质的介质的折射率如下： 空气为 1.0，水为 1.33，玻璃为 1.5，甘油为 1.47，香柏油为 1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图 1—6。 2、分辨力 D 可用下式表示： D=λ/2N.A. 可见光的波长为 0.4—0.7 微米，平均波长为 0.55 微米。若用数值孔为 0.65 的物镜，则 D=0.55 微米 /2×0.65=0.42 微米。这表示被检物体在 0.42 微米以上时可被观察到，若小于 0.42 微米就不能视见。如果 使用数值孔径为 1.25 的物镜，则 D=2.20 微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D 值 愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口 角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。 物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3、放大率： 显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最 后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2） 的乘积，即： V=V1×V2 比较精确的计算方法，可从下列公式求得 M = △ × D F 1 F 2 F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距 △=光学筒长，D=明视距离（=250 毫米） △ =接物镜的放大倍 数 D =接目镜放大倍 数 M=显微镜放大倍 数 F 1 F 2 设△=160 毫米 F1=4 毫米 D=250 毫米 F2=150 毫米 则 M= △ × D = 1 60 × 2 50 =40×16.7=668 倍 F 1 F 2 4 1 5 4、焦深： 在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的 面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径 及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易 使物象滑过而找不到。 二、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行
(-)观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时,要用右手紧握镜臂,左手托住镜座,平稳地将显微镜搬运到实 验桌上 2、将显微镜放在自己身体的左前方,离桌子边缘约10cm左右,右侧可放记录本或绘图纸。 3、调节光照不带光源的显微镜,可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照,但不能用直射阳光, 直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。 将10×物镜转入光孔,将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置,用左眼观察目镜中视野的亮度,转动 反光镜,使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时,用平面反光镜,光线较弱时,用凹面反光镜 自带光源的显微镜,可通过调节电流旋钮来调节光照强弱 4、调节光轴中心显微镜在观察时,其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心 必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜,先将光阑缩小,用10×物镜观察,在视场内可见 到视场光阑圆球多边形的轮廓像,如此像不在视场中央,可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央, 然后缓慢地将视场光阑打开,能看到光朿向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接 说明光线已经合轴。 二)低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大,易于发现 目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上,用标本夹夹住,移动推动器,使被观察的标本处在物镜正下方,转动粗调节旋钮, 使物镜调至接近标本处,用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒(或下降载物台),直至物像岀现 再用细调节旋钮使物像淸晰为止。用推动器移动标本片,找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。 〔三)高倍镜親察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜,低倍、高倍镜头是同焦的 在正常情况下,高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜,在转换物镜时要 从侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察,调节光照,使亮度适中,缓慢调节粗调节旋钮,使载 物台上升(或镜筒下降),直至物像出现,再用细调节旋钮调至物像清晰为止,找到需观察的部位,并移至 视野中央进行观察。 (四)油镜观察油浸物镜的工作距离(指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离)很短,一般在0.2mm 以内,再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”,因此使用油浸物镜时要特别细心,避免由于“调 焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损 使用油镜按下列步骤操作 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升(或将载物台下降)约2cm,并将高倍镜转出 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视,用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升,(或镜筒下降),使油浸物镜浸入香柏油中,使镜头 几乎与标本接触 4、从接目镜内观察,放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈(带视场光阑油镜开大视场光阑),上调聚光器 使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降(或镜筒上升),当岀现物像一闪后改用细调节旋钮调至 最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象,必须再从侧面观察,重复上述操作 5、观察完毕,下降载物台,将油镜头转岀,先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合 液(乙醚2份,纯酒精3份)或二甲苯,擦去镜头上残留油迹,最后再用擦镜纸擦拭2-3下即可,(注意 向一个方向擦拭)。 6、将各部分还原,转动物镜转换器,使物镜头不与载物台通光孔相对,而是成八字形位置,再将镜筒下降 至最低,降下聚光器,反光镜与聚光器垂直,用一个干净手帕将接目镜罩好,以免目镜头沾污灰尘。最后用 柔软纱布清洁载物台等机械部分, 显微镜放回柜内或镜箱中 实验二相差显微镜 (一)相差显微镜的特点相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差(即相位差)转化 为光强差的特种显微镜。 光线通过比较透明的标本时,光的波长(颜色)和振幅(亮度)都没有明显的变化。因此,用普通光学
（一）观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实 验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约 10cm 左右，右侧可放记录本或绘图纸。 3、调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光， 直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。 将 10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动 反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。 自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。 4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心 必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用 10×物镜观察，在视场内可见 到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央， 然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接， 说明光线已经合轴。 （二）低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现 目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮， 使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现， 再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。 （三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的， 在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要 从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载 物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至 视野中央进行观察。 （四）油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在 0.2mm 以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调 焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 使用油镜按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约 2cm，并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头 几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器， 使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至 最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。 5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合 液（乙醚 2 份，纯酒精 3 份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭 2—3 下即可，（注意 向一个方向擦拭）。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降 至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用 柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 实验二 相差显微镜 （一）相差显微镜的特点 相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化 为光强差的特种显微镜。 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学
显微镜观察未经染色的标本(如活的细胞)时,其形态和内部结构往往难以分辨。然而,由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同,光线通过这种标本时,直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加 或减少,加快或落后的光波的相位会发生改变(产生相位差)。光的相位差人的肉眼感觉不到,但相差 显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板,利用光的干涉现象,将光的相位差转变为人眼可以察觉 的振幅差(明暗差),从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异,对比度増强,使我们能比较淸楚 观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。 二)相差显微镜的成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环,经聚光器后聚成光束,这束光线通 过被检物体时,因各部分的光程不同,光线发生不同程度的偏斜(衍射)。由于透明圆环所成的像恰好落在 物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此,未发生偏斜的直射光便通过共轭面,而发生偏斜的衍射光则 经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同,它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位 差和强度的减弱,两组光线再经后透镜的会聚,又复在同一光路上行进,而使直射光和衍射光产生光的干涉 变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时,通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼 可以分辨的振幅差(明暗差)。 (三)相差显微镜的结构和装置相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的,所不同的是它具有 四部分特殊结构:即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片 1、环状光阑具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上,光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相 匹配的,并有一个明视场光阑,与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 2、相板位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域,直射光通过的部分叫“共轭面”,衍射光通过 的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜,常以“Ph”字样标在物镜外壳上, 相板上镀有两种不同的金属膜:吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜,它 能把通过的光线吸收掉60%—93%,相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成,它能把通过的光线相位推迟1/4 波长 根据需要,两种膜有不同的镀法,从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭 面上,通过共轭面的直射光不但振幅减弱,而且相位也被推迟1/4λ,衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4 λ,这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理,合成光等于直射光与衍射光振幅 之和,因背景只有直射光的照明,所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差,镜检效 果是暗中之明 如果吸收膜镀在共轭面,相位膜镀在补偿面上,直射光仅被吸收,振幅减少,但相位未被推迟,而通过补偿 面的衍射光的相位,则被推迟了两个1/4λ,因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根据相消干涉 原理,这样通过被检物体的合成光要比背景暗,这种效果叫正相差,即镜检效果是明中之暗。 负相差物镜( Negative contrast)用缩写字母“N”表示,正相差物镜( Positive contrast)用缩写字 母“P”表示,由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同,可分为高、中、低及低低,如0 lympus光的透过 率分为:7%、15%、20%、40%四个等级,因此分为高(High略写为H),中( Medium略写为M),低(Low 略写为L)及低低(Low-Low略写成LL)四类,构成了负高(N)、负中(NM)、正低(PL)和正低低(PL) 四种类型相差物镜,这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的 相差物镜。 3、合轴调节望远镜是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合,才能 实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉,而不该吸收的衍射光反被吸收,应推迟 的相位有的不能被推迟,这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的, 因而环状光阑与相板常不同轴。为此,相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜(在镜的外壳上标有“CT”符 号),用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜,插入合轴调节望远镜,旋转合轴调节望远镜的焦点,便能清楚 看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮,使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共 轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大,可调节聚光器的升降旋钮,使两环完全吻合。如果聚光器已 升到最高点或降到最低点而仍不能矫正,说明玻片太厚了,应更换。调好后取下望远镜,换上目镜即可进行 镜检观察
显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加 或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差 显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉 的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚 的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。 （二）相差显微镜的成像原理 镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通 过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在 物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则 经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位 差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉， 变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼 可以分辨的振幅差（明暗差）。 （三）相差显微镜的结构和装置 相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有 四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。 1、环状光阑 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相 匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 2、相板 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过 的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。 相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它 能把通过的光线吸收掉 60%—93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟 1/4 波长。 根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭 面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟 1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被推迟 1/4 λ，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅 之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效 果是暗中之明。 如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿 面的衍射光的相位，则被推迟了两个 1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后 1/2λ。根据相消干涉 原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。 负相差物镜（Negative contrast）用缩写字母“N”表示，正相差物镜（Positive contrast）用缩写字 母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如 Olympus 光的透过 率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（High 略写为 H），中（Medium 略写为 M），低（Low 略写为 L）及低低（Low—Low 略写成 LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL） 四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的 相差物镜。 3、合轴调节望远镜 是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能 实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟 的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的， 因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符 号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚 看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共 轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已 升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行 镜检观察