第十章 遗传工程 遗传工程(genetic engineering),即根据遗传学的原理，采用类似工程设计的 方法，对生物遗传物质进行有计划的技术操作，从而达到定向改造生物遗传组成，使其 获得新的遗传性状或创造新品种的过程。遗传工程是近年来，随着分子遗传学的发展而 形成的新的分支学科，也是人工改造生物遗传特性的一种新的科学技术。遗传工程包 括：细胞工程(cellular engineering)和基因工程。 第一节动物细胞工程原理概述 细胞工程，指利用细胞生物学的方法，在细胞水平上进行的遗传操作，根据研究对 象，可分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。 动物细胞工程有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植 等。其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。目前己成为一门精细的 实验科学，其应用是多方面的。许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰 素、单克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。 一、细胞融合 1.概念：细胞融合(cdlfubtm)是指在离体条件下用人工的方法把不同种的细胞通 过无性方式融合成一个杂合细胞的技术，它是一种无性杂交，故又称为体细胞杂交。精 子、卵子的结合虽然也是一种融合，但它是有性的，而且必须是在种内进行的。杂合细 胞得到了来自两个不同种细胞的染色体和细胞质。如果我们把它当作一个新的受精卵细 胞一样看待，作为一个新生命的起始来培养，就有可能长成了一个完整的生物个体，这 就是新物种或新品系。因此，细胞融合也称细胞杂交或体细胞杂交。 2.方法：诱导融合的方法可分为物理法、化学法及生物法。物理法主要包括显微 操作、电场刺激等：化学法主要是用聚乙二醇(PKG)结合高H、高钙离子法：生物法主 要有病毒法。目前细胞融合仪已很普遍。 3.应用： 细胞融合技术的应用之一是单克隆抗体技术。单克隆抗体技术通常称杂交瘤技术， 该技术是将在体外不能长期生存的免疫细胞(B淋巴细胞)与在体外能快速增殖的瘤细 胞融合产生杂交瘤细胞，这种细胞既能在体外快速增殖，又具有免疫细胞所具有的合成 与分泌抗体的能力。体内有免疫功能的淋巴细胞主要有B淋巴细胞和T淋巴细胞，B淋巴 细胞可产生特异性抗体，一个B细胞只产生一种特异性抗体；T细胞发育成吞噬细胞直接 参与细胞免疫，虽不能产生抗体，但却可以帮助B淋巴细胞产生抗体。因此，一个B细胞 与瘤细胞融合后只能产生一种特异抗体，故称单克隆抗体。与血液中的多种抗体比较， 单克隆抗体具有特异性和高纯度的优点，故有效地应用到畜牧业、生物学、医药物及蛋 白制造业。 二、胚胎干细胞及嵌合体 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cel1)一般是指从着床前胚胎内细胞团或原始生殖 细胞分离出来的具有全能性的细胞。其最显著的特点是：能保持二倍体的特性和发育的 全能性，具有与早期胚胎细胞相似的高度分化潜能，并且具有培养细胞所具有的特征， 如增殖、克隆、冷存等。 通过基因打靶技术将改造后的外源基因导入S细胞后，再把ES细胞注入动物囊胚， S细胞能够参与形成胎儿的各种细胞，包括生殖细胞。最后可发育成嵌合体动物。甚至 达到种系嵌合，从而将带有外源基因的S细胞传给后代，产生转基因动物。所以有了ES 细胞，就可以在试管内改造动物和创造动物，从而实现按照人们的意图和预先的设计， 通过操作基因来生产生长快、抗病力强、高产、优质的的家畜及产品。此外，还可以把 S细胞作上标记转入胚胎以研究发育和分化的规律以及基因的调控机理：利用S细胞还 可以为临床医学提供器官移植、器官或组织修复的原材料。 三、核移植技术 1.概念：核移植即是将一个活细胞的核移到另一个细胞中去，借以改变其某些遗 传特性的过程。提供细胞核的细胞称供体，接受核的称为受体。受体细胞大多采用动物
的卵子。因为，卵子细胞体积大易操作，且通过发育可直接表现出某些特性。细胞内原 有的核可以去掉也可不去掉。各种组织器官的细胞均可作为供体。 2.方法：移核方法是先将细胞分散，然后将细胞吸人微吸管，借助吸管壁的压力 把细胞膜挤破，把细胞核及其外面裹着的一层细胞质一同注入受体细胞。 3.研究现状：核移植研究得较多的是两栖类动物和鱼类。1997年，英国成功地将 母羊乳腺细胞核移植到卵细胞，克隆出了多莉羊，克隆动物的成功对遗传学研究和动物 发育学研究具有划时代的意义。它的成功是对传统发育学的校正和挑战。传统发育学认 为，动物组织细胞，除繁殖细胞或性细胞外都已失去全能性，也就是说这些细胞的分化 是不可逆转，不能逆转为胚胎细胞。而克隆羊的成功打破了这种传统认识，乳腺细胞被 成功地逆转为未分化细胞，使逆转的乳腺细胞再生出了又一个与其遗传组成相同的个 体。因此，动物的体细胞也可逆转而成为未分化细胞，从而进行动物的克隆。 多莉一生产了四个小羊，说明克隆动物可以繁殖后代，1999年，多莉患严重的关节 炎，这种病症与其自然年龄不符，克隆动物是否早衰成为一个迷团。2003年，多莉严重 肺炎，研究所为其实施了安乐死。至今，已有13种动物克隆成功，我国已有克隆牛和 猪。克隆动物早衰已被证实，韩国科学家解剖了28头死亡的克隆猪，发现死亡原因是由 于心脏功能性病变引起的血液循环障碍。 四、胚胎移植 胚胎移植也称受精卵移植，是指一头母畜（称为“供体”）发情排卵并经过配种后， 在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外 一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位（输卵管或 子宫角)。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下 供体的后代。其目的在于①发挥优良母畜的繁殖潜力：②促进家畜改良的速度。 五、染色休工程（亦称染色体操作）。 是按照人们的要求有计划地代换、添加或削减同种或异种染色体的全部或一部分从 而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的。广义上讲，它还应包括染色体内部的部分 遗传操作技术。 人工诱导多倍体技术已成为低等经济动物育种的主要技术之一，其成果已应用于生 产实践，取得了明显的经济效益及社会效益。 雌核发育，俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并 未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。 自然界里一些无脊椎动物和鱼类等存在雌核发育。人工诱导雌核发育是指用经过紫外 线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压 等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。雌核发育不仅 为探索个体发生中的疑谜开辟了新的途径，而且还具有潜在的实际应用价值。 雄核发育是指将经过紫外线、x射线或Y射线处理的卵子与正常的精子受精，再在 适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成完 全为父本性状的二倍体。相比之下，雄核发育研究比雌核发育要少得多。 六、动物的性别控制。性别控制是指通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望 繁殖出所需性别的后代的技术。家畜性别控制主要采用X、Y精子分离和胚胎性别鉴定技 术来实现。低等动物如鱼类等可通过性反转、人工雌或雄核发育、种间杂交等实现。实 现动物的性别控制的意义是多方面的，其中主要的是提高畜牧业的经济效益。 第二节基因工程 基因工程(Gene Engineering)又称重组DNA技术(Recombinant DNA Technique),，是 指在体外将不同来源的DNA进行剪接，形成重组DNA分子(Chimeric DNA Molecule),然 后将其导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因产 物的过程。 基因工程的施工程序大致分为四个步骤： 1.准备施工材料，即“目的基因、载体和工具酶等
2.把目的基因与载体（克隆载体或表达载体）结合成重组DNA分子。 3.把重组DNA分子导入受体细胞，建立分子无性繁殖系(Cloe)或称克隆。 4.从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中克隆或正确表 达。 一、目的基因的分离和合成 (一)目的基因及基因文库的概念 “日的”基因即在遗传工程中那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因 或DNA片段。这些基因或DNA片断，主要是从特定的组织、细胞或器官提取染色体基因组 DNA或通过提取的mRNA反转录合成cDNA。由于单个基因仅占染色体DNA分子总量的极微 小的比例，必须经过扩增，才有可能分离到特定的含有目的基因的DNA片段，故需先构建基 因库。基因文库就是保存某一生物的全部基因组遗传信息的材料。一般是将某一生物的DNA 用酶切成片断，将这些片断与载体连接后再转化到细菌中去，这样每一个转化了的细菌含有 基因组DNA中的一段，并能扩增繁殖，许多细胞一起组成的含有基因组各DNA片断克隆的 集合体，就称为基因组DNA文库。 在建立了成千上万个无性繁殖的生物基因组片段的“仓库”之后，研究者在寻找任何一 种含目的基因（目标DNA)的细胞时，就可以从这些文库中去筛选，可不必再重复地进行整个 无性繁殖的操作。有了文库的概念，日的基因的制取过程就可理解为是从DNA文库中“钓 出”目的基因的过程。不过不论是由细胞总DNA建立的基因组文库，还是由mRNA逆转录而 成的cDNA建立的cDNA文库，都还是混合物.还要对文库进行筛选，才能获得目的基因。 (二)基因工程工具酶 基因工程研究中使用的酶称之为基因工程工具酶，或分子克隆工具酶，是一类用于 DNA重组过程中DNA分子的制备、切割、连接、修饰、扩增，核酸分子的标记以及它们的 核苷酸序列测定的酶。基因工程中主要的酶有： 1.限制性核酸内切酶 限制性内切酶是一类主要分离于原核生物，能够识别双链DNA(ds-DNA)分子中特定 核苷酸序列并能在特定部位将其切断的酶，常常简称为限制酶(restriction enzymes)。不 同的酶识别的部位不同。在基因工程中，限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行DNA 分子切割的特殊工具。因此它有“分子剪刀或“分子手术刀之称。 大部分限制性核酸内切酶所识别的双链DNA分子中特定的序列具有双重交替式的对 称点，即从5到3'方向读这段DNA的单链碱基，会发现两条互补链的碱基是相同的。限 制性内切酶切割DNA的结果有三种不同的情况：产生3'突出的粘性末端；产生5'突出的 粘性末端；产生平末端(Blunt end)。黏性末端可与用同一个酶切割的DNA片段退火连 接，因为黏性末端是互补的，平端可用连接力极强的连连接接酶进行“端接”，也可用末 端转种 端上 性粘性去洪”庙在垶 EcoRI HindIⅢ Hpal GAATTC3. AAGCTT5 GTT 现在限制性内切酶己达500种，在了解各种限制性内切酶“切割”特点的基础上，巧妙 利用相互的关系，即可将DNA分子按人的愿望切割成大小不同、未端不同的片段，供DNA
重组运用。 2.T4DNA连接酶 T4DNA连接酶是分子克隆实验中最常用的工具酶之一，该酶催化双链DNA分子中相邻 的3'-羟基和5'-磷酸基间磷酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段， 也可以连接两个具有平端的DNA片段，但是连接后者所需的酶量往往是连接前者的50倍。 在分子克隆过程中，有时为了避免载体DNA的自我连接，常常要将限制酶所产生的S' 磷酸基用磷酸酶除去，因而当用连接酶将载体DNA和外源DNA分子连接时，DNA双链中只 有一条链是连接起来的，另一条链的连接则是把DNA转移到宿主细胞后由细胞内的连接酶完 成的。 3.DNA聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以DNA作为模板合成新的DNA链，不同的DNA聚合酶或 反转录酶可用于上述的不同目的。 4.反转录酶 它具有依赖于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和活性。这就是说，反转录酶可以以 mRNA分子为模板，合成出一条DNA链(cDNA)。 5.末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶可将三磷酸脱氧核苷酸中的单磷酸核苷转移到DNA分子的3'端 羟基。末端转移酶主要用在建立重组DNA分子时在DNA片段末端加上一个同聚物尾巴，两 种不同的DNA分子加上不同的但可以互补（即A和T,C和G)的尾巴后，经过退火或复性，两 种尾巴便可以借助互补作用连接在一起。这种加尾方法在cDNA文库建立时是使cDNA插入载 体中的常用方法之一。 6.核酸酶 (I)RNaseA:是作用于RNA的专一性内切酶，它特异性地作用于嘧啶核苷酸，该酶主 要用于除去DNA制备物中的RNA。 (2)RNase H:该酶只能专一性地分解DNA-RNA杂交分子中的RNA分子。主要用于 cDNA合成过程中除去cDNA-RNA中的RNA链， (三)日的基因的获得 1.利用鸟枪射击法(Shotgun)分离基因（受体菌筛选法） 这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。当基因文库建立后，就可以用某种检测 方法挑选含有特定目的基因的单一受体细胞。有时，人们根据重组克隆明显的表型变化，通 过直接观察，挑选含有目的基因的单一细胞株。而当某些目的基因能地某一细胞株中表达出 特定的基因产生时，还可用免疫学方法检测这些产物，间接证明某个或某些细胞中含有目的 基因。另外，还有核酸探针法，核酸探针是人工合成的用放射性同位素可其它标记物标记的 与目的基因互补的DNA或RNA片断，用它可以直接进行特定基因的检测，常用菌落原位杂 交法筛选含目的基因的受体。 菌落原位杂交是将生长在平板上的菌落转移到硝酸纤维膜上，然后将滤膜上的菌落用 NaOH处理理使其裂解，DNA变性并释放出到纤维膜上，中和并将DNA烘干，使其固定在膜 上。将DNA与32P标记的探针在塑料代内进行杂交，然后用一定粒子强度的溶液将非专一性 结合的仅仅是吸附在膜上的放射性物质除去再烘干纤维膜，进行放射自显影，从胶片上可以 看到曝光点，即代表杂交上的菌落，再按底片的菌落位置找出培养基上的相应菌落
鸟枪射击法分离日的基因的持点是绕过直接分离基因的难关、在基因组DNA文库中筛 选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。因目的基因在整 个基因组中太少大小，在相当程度上还得靠“碰运气”所以人们称这个方法为“鸟枪 法”或“散弹枪”实验法。 2.酶促逆转录合成法 酶促逆转录合成法即利用逆转录酶由mRNA逆转录合成互补DNA,即cDNA的方法。主 要用于合成分子量较大而又不知其序列的基因。这种方法是以目的基因的mRNA为模板，借 助逆转录酶合成互补的DNA,即cDNA,再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与 适当的载体结合后转入受体菌，扩增为cDNA文库。然后，采用适当的方法从cDNA文库中筛 选出目的基因。 3.聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(PCR)也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细 胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增。PCR技术的基本原理类似于DNA的天 然复制过程，其由高温变性一一低温复性一一中温延伸三个基本反应步骤构成。首先，根据 模板DNA片段两端的核苷酸序列，合成2个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的2条 链互补配对(DNA正链5·端的引物称正向引物，上游引物，简称5引物，与正链3·端互 补的引物称为反向引物，下游引物，简称3·引物)。将适量的寡聚核苷酸引物与4种脱氧核 糖核酸(dNTP)、DNA聚合酶以及模板DNA分子混合，经过高温变性（使DNA双链解 开)、低温退火（使引物与模板附着）和中温延伸（合成新的DNA片段）3个阶段的1次循 环，DNA的量即可以增加1倍，重复此过程，DNA的量以指数方式扩增。一般循环30-40次。 PCR的特异性主要依赖于与模板两端互补的寡核苷酸引物，因此引物序列的设计是PCR成攻 的关键。 4、基因的化学合成 如果已知某种基因的核苷酸序列，或者根据某种基因产物的氨基酸序列，仔细选择密码 子，可以推导出编码该多肽基因的核苷酸序列，然后然后利用化学方法，就可以将核苷酸或 寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段。 为保证定向合成，需要将一个分子的5·端与另一个分了的3端封闭保护。这种封闭可用磷酸 化等方法。必要时可以酸或碱解除封闭。 二、载体 能将外源基因DNA带入宿主细胞并能复制或最终使外源基因DNA表达的自主DNA分子， 称为载体(Vector)。在载体DNA的运载和保护下，被转移的基因可以高效率地进入受体细 胞，并在其中复制、扩增、转录和翻译。通常载体都具备以下三个基本的结构：①至少有一 个复制起点及启动子，因而至少可在一种生物体中自主复制：②有多种限制酶的切点，每种 酶的切点最好只有一个，以便特异性地连接目的基因，酶切后并不损坏其复制能力及选择标 志基因（酶切位点不在复制原点和标志基因内），并能嵌入外源DNA的片段。③至少应有 个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 目前只有少数的细菌质粒，噬菌体，类人猿病毒SV40符合上述的条件。 质粒是细菌染色体外的小型环状DNA。一般为细菌染色体DNA的0.5~3%，质粒含有一 个复制子，能在细菌内自我复制，并能插入到细菌染色体上以附加的形式进行复制。 (基因工程中最有意义的质粒有两类：一类是对多种药物以及重金属和紫外线有抗性的 质粒：一类是携带有合成大肠杆菌素基因的质粒。大肠杆菌素是具有蛋白质性质的抗生素， 它使大肠杆菌敏感株致死。) 入噬菌体是一种大肠杆菌双链DNA噬菌体，不易引起生物危害，它失去其DNA总量的 25%,仍不失活，这一部分DNA的空挡正好用于转运其他DNA。而且用它作为载体DNA有