First CycleThird CycleSecond CycleMelt Anneal ReplicateMelt Anneal ReplicateMelt Anneal ReplicateTemperatureTime
二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等
二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶 和 缓冲液等
1模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等模板DNA需较高的浓度RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng
1 模板 ◼ 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 ◼ 模板DNA需较高的浓度 ◼ RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板 ◼ 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng
2、引物（Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度是化学合成的寡核苷酸片段化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则
2、引 物（Primers) 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度， 是化学合成的寡核苷酸片段 ◼ 化学合成的寡核苷酸 ◼ 能与模板特异地结合 ◼ 引物决定产物的特异性和长度 ◼ 引物设计时必须遵循一些原则
设计引物的原则：二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18~25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5端可被修饰（引入酶切位点、弓入突变位点、生物素等标记）引物浓度：0.1~0.2umol/L，浓度过高容易生成引物二聚体
设计引物的原则： ◼ 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负 链序列互补 ◼ 长度为18 ~ 25个核苷酸 ◼ 二条引物之间避免形成引物二聚体 ◼ 引物的碱基组成应平衡 ◼ 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G） ◼ 引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位 点、生物素等标记） 引物浓度：0.1 ~ 0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体