D0I:10.13374/i.issnl00113.2007.06.027 第29卷第6期 北京科技大学学报 Vol.29 No.6 2007年6月 Journal of University of Science and Technology Beijing Jun.2007 降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用 林海陆钢张庆娜吕绿洲贾秀明 北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083 摘要为了提高造纸废水生化处理效果，进行了降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定和应用实验·对从市政污水处理厂采 集的活性污泥样品进行培养、驯化、分离和鉴定等一系列实验，得到了能够降解木质素的生物降解菌，通过研究其生理生化特 性，确定该菌为白腐菌，属于短杆状，好氧型产碱菌·经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌·进一步驯化从中挑选出有较强降解 能力的菌种并进行实际废水环境下的应用实验，结果显示该菌对造纸废水C0D的去除率可达到80.9%. 关键词废水处理：造纸废水：木质素：白腐菌：筛选：驯化 分类号X172,X506 造纸行业是我国的一个支柱产业，目前年总产 1.2培养基 值超过3000万t,仅次于美、日两国，居世界第三 肉膏蛋白胨培养基可：专项培养基(gL-): 位，据1998年统计，全国制浆造纸工业年排废水量 KH2P041.0,NaH2P040.2,Mgs04·7H200.5, 为2.4×10°m3,约占全国工业废水排放总量的 VB1×10-3,CaC21×10-4,Fes04.7H200.1, 11%,其中C0Dc排放总量为321.4万t,为全国第 ZnS04.7H201×10-5,CS04.5H202×10-4,葡 一污染行业).造纸废水中含有大量木质素]. 萄糖1.0，洒石酸铵0.1：造纸废水培养基：成分为 木质素降解微生物在工程实际应用中有着广阔的前 液体专项培养基十造纸废水（取自河南淇县造纸 景，孙先锋、张志杰等经反复驯化培养和划线分 厂) 离，获得了6株能在以木质素为唯一碳源的培养基 1.3菌种驯化、分离及鉴定 上生长的菌种，6株菌均能不同程度降解木质素， 驯化初期投加营养液，而后逐步剔除营养物，提 其中一种的木质素去除率达到了23.4%.郭鹏、陈 高目标降解物的比例，直至营养基质全部为目标降 敏等可从自然筛选、紫外诱变筛选两个角度，对取 解物 自SBR处理系统中的活性污泥进行驯化筛选， 分离方法采用稀释倒平板法和平板划线分离 Joyce等6采用白腐菌为优势微生物的新型生物转 法9] 盘MyCoR反应器处理纸厂漂白废水，同时去除 鉴定方法采用Bavendamm反应和革兰氏染色 CODc和BOD,并使氯化木素脱氯 法91. 本文研究了木质素降解微生物白腐菌的生理生 1.4评价指标 生物相采用镜检；CODc,测定采用标准重铬酸 化特性，通过对目标微生物的分离鉴定及生理生化 特性研究，得出其对木质素降解的一系列参数，并将 钾滴定法]；生长量测定采用比浊法町. 其用于造纸废水的初步处理 2结果与分析 1材料与方法 2.1菌种驯化 250mL三角瓶装50mL营养液(C、N和P的质 1.1菌种来源 量比为100：51，C0Dc为250mgL-1,pH为7.2)， 北京城市排水集团高碑店污水处理厂二沉池回 接入污泥，摇床转速120rmim1,32℃下（若无特殊 流污泥 说明，下文基础条件均为此)培养.经过三个周期 收稿日期：.2006-06-14修回日期：2006-10-11 (6d)后，经显微镜观察，瓶内微生物生长良好，钟 基金项目：北京市教育委员会共建项目建设计划(N 虫、累枝虫大量繁殖，后生动物轮虫、线虫活性较高， XK100080432):北京科技大学校基金(NBIC)重点资助课题(No NBIC-) 出水C0Dc,的去除率稳定在90%，表明微生物已经 作者简介：林海(1966一)男，教授，博士生导师 适应了现有的培养环境
降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用 林 海 陆 钢 张庆娜 吕绿洲 贾秀明 北京科技大学土木与环境工程学院北京100083 摘 要 为了提高造纸废水生化处理效果进行了降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定和应用实验．对从市政污水处理厂采 集的活性污泥样品进行培养、驯化、分离和鉴定等一系列实验得到了能够降解木质素的生物降解菌．通过研究其生理生化特 性确定该菌为白腐菌属于短杆状、好氧型产碱菌．经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌．进一步驯化从中挑选出有较强降解 能力的菌种并进行实际废水环境下的应用实验结果显示该菌对造纸废水 CODCr的去除率可达到80∙9％． 关键词 废水处理；造纸废水；木质素；白腐菌；筛选；驯化 分类号 X172X506 收稿日期：2006－06－14 修回日期：2006－10－11 基金 项 目： 北 京 市 教 育 委 员 会 共 建 项 目 建 设 计 划 （ No． XK100080432）；北京科技大学校基金（NBIC）重点资助课题（No． NBIC－4） 作者简介：林 海（1966－）男教授博士生导师 造纸行业是我国的一个支柱产业目前年总产 值超过3000万 t仅次于美、日两国居世界第三 位．据1998年统计全国制浆造纸工业年排废水量 为2∙4×109 m 3约占全国工业废水排放总量的 11％其中 CODCr排放总量为321∙4万 t为全国第 一污染行业［1－2］．造纸废水中含有大量木质素［3］． 木质素降解微生物在工程实际应用中有着广阔的前 景．孙先锋、张志杰等［4］经反复驯化培养和划线分 离获得了6株能在以木质素为唯一碳源的培养基 上生长的菌种．6株菌均能不同程度降解木质素 其中一种的木质素去除率达到了23∙4％．郭鹏、陈 敏等［5］从自然筛选、紫外诱变筛选两个角度对取 自SBR 处理系统中的活性污泥进行驯化筛选． Joyce 等［6］采用白腐菌为优势微生物的新型生物转 盘 MyCoR 反应器处理纸厂漂白废水同时去除 CODCr和 BOD并使氯化木素脱氯． 本文研究了木质素降解微生物白腐菌的生理生 化特性通过对目标微生物的分离鉴定及生理生化 特性研究得出其对木质素降解的一系列参数并将 其用于造纸废水的初步处理． 1 材料与方法 1∙1 菌种来源 北京城市排水集团高碑店污水处理厂二沉池回 流污泥． 1∙2 培养基 肉膏蛋白胨培养基［7］；专项培养基（g·L －1） ［8］： KH2PO41∙0NaH2PO40∙2MgSO4·7H2O 0∙5 VB 1×10－3CaCl21×10－4FeSO4·7H2O 0∙1 ZnSO4·7H2O 1×10－5CuSO4·5H2O 2×10－4葡 萄糖1∙0洒石酸铵0∙1；造纸废水培养基：成分为 液体专项培养基＋造纸废水（取自河南淇县造纸 厂）． 1∙3 菌种驯化、分离及鉴定 驯化初期投加营养液而后逐步剔除营养物提 高目标降解物的比例直至营养基质全部为目标降 解物． 分离方法采用稀释倒平板法和平板划线分离 法［9］． 鉴定方法采用 Bavendamm 反应和革兰氏染色 法［9］． 1∙4 评价指标 生物相采用镜检；CODCr测定采用标准重铬酸 钾滴定法［9］；生长量测定采用比浊法［9］． 2 结果与分析 2∙1 菌种驯化 250mL 三角瓶装50mL 营养液（C、N 和 P 的质 量比为100∶5∶1CODCr为250mg·L －1pH 为7∙2） 接入污泥摇床转速120r·min －132℃下（若无特殊 说明下文基础条件均为此）培养．经过三个周期 （6d）后经显微镜观察瓶内微生物生长良好钟 虫、累枝虫大量繁殖后生动物轮虫、线虫活性较高 出水 CODCr的去除率稳定在90％表明微生物已经 适应了现有的培养环境． 第29卷 第6期 2007年 6月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol．29No．6 Jun．2007 DOI:10．13374／j．issn1001－053x．2007．06．027
·570 北京科技大学学报 第29卷 此时开始逐步加入造纸废水对活性污泥进行驯 2.3菌种鉴定 化.在利用造纸废水逐步替代营养液对污泥驯化的 培养1d后A、B两菌种在原水滴周围有生长菌 阶段，每个原水比例条件下均做了换水周期为1d 落出现，C菌种没有在原水滴周围生长的情况：培养 和2的两个测试以寻求适合目标微生物的培养条 2d后A、B两菌种在培养皿内都生长，并且均能在 件，结果见表1. 原水周围生长出菌落，C菌种仍没有出现在原水周 表1驯化期间CODr去除率 围的菌落（培养1周后，仍没有出现） Table 1 Removal rate of CODo in the domestication period 实验证实经驯化后的杂菌中含有两种可适应造 CODo去除率/% 纸废水的单一性状菌种，它们都有可能是目标菌种 原水比例/% 白腐菌， 换水周期1d 换水周期2d 经两次连续分离后主要获得两种菌：一种为绿 10 85.5 88.6 色绒粒状菌，初步认为是绿色木霉，镜检为丝状；另 20 80.8 86.5 一种为白色绒状，初步认为是白腐菌，镜检为长 40 76.5 80.4 丝菌 % 79.5 75.7 在培养皿中接种白色绒状菌落，用加入琼脂及 80 69.2 73.2 少量单宁酸的专项培养基培养，温度控制在32℃， 100 70.5 74.0 经2d培养后，在菌落外侧形成了肉眼可见的褐色 轮环，可见接种的白色绒状菌是白腐菌， 在驯化的末期，原水比例提至100%后，测得换 对已鉴别出的目标菌种一白腐菌一进行革 水周期为2d时出水C0Dc,去除率达到了74%，镜 兰氏染色后，在显微镜下观察发现，目标菌种为紫 检瓶内微生物活性良好，轮虫、线虫等后生动物大量 色，根据革兰氏染色原理，可判定该菌种为革兰氏 繁殖，钟虫、累枝虫等固着型纤毛虫虽数量不及培养 阳性菌.菌种的形状为短杆状，见图2和图3. 期间但个体活性较好，以此可间接反映出目标微生 物生长良好，对造纸废水的降解效果明显 2.2菌种分离 菌种分离结果见图1.图中，A种菌落内圈为绿 色绒粒，中圈为绿色与白色混杂，最外圈为乳白色绒 粒；B种菌落大部分为白色茸状，边缘有少量黄绿色 菌生长；C种菌落大部分为淡黄色绒粒状，镜检均有 少量菌丝孢子， 图2普通显微镜下菌种革兰氏染色照片 Fig.2 Microscope photo of Gram-stained bacteria 图1杂菌接种普通培养基3d后照片 Fig-1 Photo of mixed-bacteria inoculation ordinary culture medi- um after 3d 培养5d后，培养基上菌落蔓延至整个培养皿 中.A菌落外圈为白绒状，内圈全变绿；B几乎全为 图3油镜下菌种革兰氏染色照片 白色；C仍为淡黄色绒粒，镜检菌丝不发达 Fig.3 Oil lens photo of Gramstained bacteria
此时开始逐步加入造纸废水对活性污泥进行驯 化．在利用造纸废水逐步替代营养液对污泥驯化的 阶段每个原水比例条件下均做了换水周期为1d 和2d 的两个测试以寻求适合目标微生物的培养条 件结果见表1． 表1 驯化期间 CODcr去除率 Table1 Removal rate of CODCr in the domestication period 原水比例／％ CODCr去除率／％ 换水周期1d 换水周期2d 10 85∙5 88∙6 20 80∙8 86∙5 40 76∙5 80∙4 60 79∙5 75∙7 80 69∙2 73∙2 100 70∙5 74∙0 在驯化的末期原水比例提至100％后测得换 水周期为2d 时出水 CODCr去除率达到了74％镜 检瓶内微生物活性良好轮虫、线虫等后生动物大量 繁殖钟虫、累枝虫等固着型纤毛虫虽数量不及培养 期间但个体活性较好以此可间接反映出目标微生 物生长良好对造纸废水的降解效果明显． 2∙2 菌种分离 菌种分离结果见图1．图中A 种菌落内圈为绿 色绒粒中圈为绿色与白色混杂最外圈为乳白色绒 粒；B 种菌落大部分为白色茸状边缘有少量黄绿色 菌生长；C 种菌落大部分为淡黄色绒粒状镜检均有 少量菌丝孢子． 图1 杂菌接种普通培养基3d 后照片 Fig．1 Photo of mixed-bacteria inoculation ordinary culture medium after3d 培养5d 后培养基上菌落蔓延至整个培养皿 中．A 菌落外圈为白绒状内圈全变绿；B 几乎全为 白色；C 仍为淡黄色绒粒镜检菌丝不发达． 2∙3 菌种鉴定 培养1d 后 A、B 两菌种在原水滴周围有生长菌 落出现C 菌种没有在原水滴周围生长的情况；培养 2d 后 A、B 两菌种在培养皿内都生长并且均能在 原水周围生长出菌落C 菌种仍没有出现在原水周 围的菌落（培养1周后仍没有出现）． 实验证实经驯化后的杂菌中含有两种可适应造 纸废水的单一性状菌种它们都有可能是目标菌种 －－－白腐菌． 经两次连续分离后主要获得两种菌：一种为绿 色绒粒状菌初步认为是绿色木霉镜检为丝状；另 一种为白色绒状初步认为是白腐菌镜检为长 丝菌． 在培养皿中接种白色绒状菌落用加入琼脂及 少量单宁酸的专项培养基培养温度控制在32℃ 经2d 培养后在菌落外侧形成了肉眼可见的褐色 轮环可见接种的白色绒状菌是白腐菌． 对已鉴别出的目标菌种－－－白腐菌－－－进行革 兰氏染色后在显微镜下观察发现目标菌种为紫 色．根据革兰氏染色原理可判定该菌种为革兰氏 阳性菌．菌种的形状为短杆状．见图2和图3． 图2 普通显微镜下菌种革兰氏染色照片 Fig．2 Microscope photo of Gram-stained bacteria 图3 油镜下菌种革兰氏染色照片 Fig．3 Oil lens photo of Gram-stained bacteria ·570· 北 京 科 技 大 学 学 报 第29卷
第6期 林海等：降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用 .571. 2.4菌种理化性质鉴定 稳定，菌种进入衰亡期.故白腐菌为好氧菌 2.4.1生长曲线 3.6 采用原菌水，用可见光分光光度计测定，最佳波 3.2 长确定如图4所示，由不同波长时菌液的吸光度曲 2.8 线可知，520nm为菌液测定时的最佳波长.白腐菌 24 的生长曲线见图5. 2.0 0.100 1.60 0.096 9.o 0 10 203040506070 时间h 0.092 0.088 o 图6菌种溶解氧随时间变化曲线 Fig.6 Curve of the dissolved oxygen of white-rot fungi-contained 0.084 solution with time 0.080 350 400450500,550600650 2.4.3产酸碱性 波长/nm 图7表示了在不同污染负荷条件下pH值随时 图4不同波长时菌液的吸光度 间的变化规律.可以看出，原水比例为20%及50% Fig.4 Absorptivity of bacteria-contained liquid at different wave 的两组曲线在整个实验过程中均呈偏碱性，变化比 lengths 较平稳，pH值略有升高.70%和100%的两组曲线 0.18 在0~12h范围pH值有微小下降，24h后pH值明 显增大，由偏酸性升至弱碱性.48h后pH值保持稳 0.16 定，由此可以看出该菌种应为产碱菌， 8.0 7.8 0.10 7.6 7.4 0.08 0 10203040506070 7.2 时间h 0-20% 7.0 口50% 合70% 图5白腐菌的生长曲线 6.82 -×-100% Fig.5 Growth curve of white-rot fungi 6.60立24364860力8496 参照白腐菌生长曲线可以看出，菌种在经过大 时间h 约10h的停滞期后，吸光度值开始明显增大，进入 图7不同污染负荷条件下pH值的变化曲线 对数生长期，这一阶段持续了15h,此后吸光度值 Fig.7 Changes of pH value under different pollution loadings 增至最大并基本保持稳定，菌种开始稳定生长期. 从第45h后，吸光度值缓慢下降，菌体走向衰亡，至 2.5菌种处理废水 70h菌种完成一个生长周期 2.5.1单菌种进一步驯化 2.4.2生长类型 将已经保藏的菌种取少量孢子（挖块）转接于含 判断白腐菌的代谢类型，进行了溶解氧测试，见 10%造纸废水的平板上培养，如果菌种在平板上有 图6.由图可见：停滞期溶解氧迅速增至3.3 生长，则将平板上的优势菌种按同样方式依次转接 mgL左右，低于同条件下空白实验溶解氧值，表 于含20%和40%造纸废水的平板上培养，并从中挑 明在菌种生长初期即需微量溶解氧的参与：15h后 选生长速度快的菌种，经过上述选育后，得到了可 菌种在对数生长期和稳定生长期阶段溶解氧由最大 在含40%造纸废水的平板上生长良好的菌种. 值3.5mgL-1开始下降至45h的2.3mgL-1,接 进一步驯化过程中，经镜检可以发现当菌种逐 种活菌的实验结果表明，该菌种的生长时需要氧气 步从培养基过渡到一定含量实际造纸废水的营养源 参与的，同时当瓶内溶解氧开始降低时，也是吸光度 过程中，其部分生长过程是下降的，同时菌丝有所减 曲线上菌种数量增长的时间点；此后溶解氧值保持 少（平均长度约为原来的50%，造纸废水40%下测
2∙4 菌种理化性质鉴定 2∙4∙1 生长曲线 采用原菌水用可见光分光光度计测定最佳波 长确定如图4所示．由不同波长时菌液的吸光度曲 线可知520nm 为菌液测定时的最佳波长．白腐菌 的生长曲线见图5． 图4 不同波长时菌液的吸光度 Fig．4 Absorptivity of bacteria-contained liquid at different wave lengths 图5 白腐菌的生长曲线 Fig．5 Growth curve of white-rot fungi 参照白腐菌生长曲线可以看出菌种在经过大 约10h 的停滞期后吸光度值开始明显增大进入 对数生长期这一阶段持续了15h．此后吸光度值 增至最大并基本保持稳定菌种开始稳定生长期． 从第45h 后吸光度值缓慢下降菌体走向衰亡．至 70h 菌种完成一个生长周期． 2∙4∙2 生长类型 判断白腐菌的代谢类型进行了溶解氧测试见 图 6．由 图 可 见：停 滞 期 溶 解 氧 迅 速 增 至 3∙3 mg·L －1左右低于同条件下空白实验溶解氧值表 明在菌种生长初期即需微量溶解氧的参与；15h 后 菌种在对数生长期和稳定生长期阶段溶解氧由最大 值3∙5mg·L －1开始下降至45h 的2∙3mg·L －1接 种活菌的实验结果表明该菌种的生长时需要氧气 参与的同时当瓶内溶解氧开始降低时也是吸光度 曲线上菌种数量增长的时间点；此后溶解氧值保持 稳定菌种进入衰亡期．故白腐菌为好氧菌． 图6 菌种溶解氧随时间变化曲线 Fig．6 Curve of the dissolved oxygen of white-rot fung-i contained solution with time 2∙4∙3 产酸碱性 图7表示了在不同污染负荷条件下 pH 值随时 间的变化规律．可以看出原水比例为20％及50％ 的两组曲线在整个实验过程中均呈偏碱性变化比 较平稳pH 值略有升高．70％和100％的两组曲线 在0～12h 范围 pH 值有微小下降24h 后 pH 值明 显增大由偏酸性升至弱碱性．48h 后 pH 值保持稳 定．由此可以看出该菌种应为产碱菌． 图7 不同污染负荷条件下 pH 值的变化曲线 Fig．7 Changes of pH value under different pollution loadings 2∙5 菌种处理废水 2∙5∙1 单菌种进一步驯化 将已经保藏的菌种取少量孢子（挖块）转接于含 10％造纸废水的平板上培养如果菌种在平板上有 生长则将平板上的优势菌种按同样方式依次转接 于含20％和40％造纸废水的平板上培养并从中挑 选生长速度快的菌种．经过上述选育后得到了可 在含40％造纸废水的平板上生长良好的菌种． 进一步驯化过程中经镜检可以发现当菌种逐 步从培养基过渡到一定含量实际造纸废水的营养源 过程中其部分生长过程是下降的同时菌丝有所减 少（平均长度约为原来的50％造纸废水40％下测 第6期 林 海等： 降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用 ·571·
.572. 北京科技大学学报 第29卷 得)，如图8所示 CODc,缓慢下降，曲线相对平稳 1000 -pH 5 pH 7 700 -X-pH 8 (13w)o 400 100 24 48 72 时间h 图8进一步驯化后菌种照片 图10不同初始pH值条件下COD。的变化曲线 Fig-8 Photo of white-rot fungi after further domestication Fig-10 Change of CODor at different initial pH values 2.5.2污染物负荷的影响 初始pH值为8的曲线在0~24h内C0Dc先 从图9可以看出，原水比例为100%的曲线较 增大，此后曲线的变化趋势与其他三组保持一致， 为特殊，在初期C0Dc,反常的有所升高，从24h开 但本条件下的CODc,去除效果较差，考虑这是因为 始，CODc的变化才与其他曲线趋于一致，导致这一 菌种不适合在初始呈碱性的环境中生长，分析 现象的原因可能是因为在这一污染负荷下，白腐菌 CODc增大的原因是在此初始条件下，菌种先进行 先对木质素进行吸附，木质素被解吸出来使测得的 木质素的吸附作用，木质素被解吸出来导致CODc CODc增大，之后白腐菌开始对木质素的降解， 增大，此后菌种开始对其进行降解。由曲线还可得 CODc降低 出初始pH值为5时CODc的去除效果最佳，表明 1000 菌种适宜在初始呈酸性的环境中生存 0-20% 2.5.4溶解氧的影响 口-50% 在-70% 图11显示了在不同初始溶解氧条件下，各曲线 700 X-100% 的变化趋势基本一致，所不同的是，溶解氧初始值 为2mgL-1和3mgL-1的两条曲线在0~24h内 400 CODc,变化较小，此后C0Dc,迅速降低.60h后变化 又趋于平缓.初始值为4mgL和5mgL的两 条曲线则从培养初期开始CODc的下降就很明显， 100 0 24 48 72 时间h 6Oh后的CODc基本稳定，保持不变.在此前的实 验阶段，已初步判定目标菌种为好氧型，因而初始溶 图9不同污染负荷条件下CODc的变化曲线 解氧为4mgL-1和5mgL一1的条件提供了菌种生 Fig.Change curves of CODor under different pollution loadings 1000 ◇2mgL 分析曲线还可发现，菌种对污染物的降解速率 口-3mgL4 ☆4mgL4 并不与前面得出的生长曲线中粗分出的生长时期保 700 -x-5 mg.L- 持一致，这是由于环境的影响所致，污染物的浓度改 变了菌种所处的生长时期. 2.5.3pH值的影响 400 微生物必须在一定条件下生长，如光合细 菌1o,废水pH值的影响结果见图10. 1000 24 48 72 96 由CODc.变化曲线可以看出，初始pH值为5， 时间h 6和7的三条曲线变化趋势较为一致，在0~24h 图11不同初始溶解氧条件下COD。的变化曲线 C0Dc下降相对缓慢，24~48hC0Dc迅速减小，去 Fig-11 Changes of CODrat different initial dissolved oxygen con 除率分别达到67.4%，56.8%和43.4%，此后 tents
得）如图8所示． 图8 进一步驯化后菌种照片 Fig．8 Photo of white-rot fungi after further domestication 2∙5∙2 污染物负荷的影响 从图9可以看出原水比例为100％的曲线较 为特殊在初期 CODCr反常的有所升高从24h 开 始CODCr的变化才与其他曲线趋于一致．导致这一 现象的原因可能是因为在这一污染负荷下白腐菌 先对木质素进行吸附木质素被解吸出来使测得的 CODCr增大之后白腐菌开始对木质素的降解 CODCr降低． 图9 不同污染负荷条件下 CODCr的变化曲线 Fig．9 Change curves of CODCr under different pollution loadings 分析曲线还可发现菌种对污染物的降解速率 并不与前面得出的生长曲线中粗分出的生长时期保 持一致这是由于环境的影响所致污染物的浓度改 变了菌种所处的生长时期． 2∙5∙3 pH 值的影响 微生物 必 须 在 一 定 条 件 下 生 长如 光 合 细 菌［10］废水 pH 值的影响结果见图10． 由 CODCr变化曲线可以看出初始 pH 值为5 6和7的三条曲线变化趋势较为一致在0～24h CODCr下降相对缓慢24～48h CODCr迅速减小去 除率 分 别 达 到 67∙4％56∙8％ 和 43∙4％此 后 CODCr缓慢下降曲线相对平稳． 图10 不同初始 pH 值条件下 CODCr的变化曲线 Fig．10 Change of CODCr at different initial pH values 初始 pH 值为8的曲线在0～24h 内 CODCr先 增大此后曲线的变化趋势与其他三组保持一致． 但本条件下的 CODCr去除效果较差考虑这是因为 菌种不适合在初始呈碱性的环境中生长．分析 CODCr增大的原因是在此初始条件下菌种先进行 木质素的吸附作用木质素被解吸出来导致 CODCr 增大此后菌种开始对其进行降解．由曲线还可得 出初始 pH 值为5时 CODCr的去除效果最佳表明 菌种适宜在初始呈酸性的环境中生存． 2∙5∙4 溶解氧的影响 图11 不同初始溶解氧条件下 CODCr的变化曲线 Fig．11 Changes of CODCr at different initial dissolved oxygen contents 图11显示了在不同初始溶解氧条件下各曲线 的变化趋势基本一致．所不同的是溶解氧初始值 为2mg·L －1和3mg·L －1的两条曲线在0～24h 内 CODCr变化较小此后 CODCr迅速降低．60h 后变化 又趋于平缓．初始值为4mg·L －1和5mg·L －1的两 条曲线则从培养初期开始 CODCr的下降就很明显 60h 后的 CODCr基本稳定保持不变．在此前的实 验阶段已初步判定目标菌种为好氧型因而初始溶 解氧为4mg·L －1和5mg·L －1的条件提供了菌种生 ·572· 北 京 科 技 大 学 学 报 第29卷
第6期 林海等：降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用 .573 长所需足够的氧，大大提高了其适应环境的能力，在 参考文献 培养初期即表现出良好的降解效果， [1]庾晋，周洁.我国造纸业发展现状和趋势.黑龙江造纸，2001， 4.10 3结论 [2]林云琴，周少奇.白腐菌降解纤维素和木质素的研究进展.环 (1)通过采样、驯化、分离和鉴定等一系列实 境技术，2003,4：29 [3]韦朝海，任源.淮河流域酿造业生产与环境污染的损益分析， 验，培养出能够降解木质素的生物降解菌一白 食品与发酵工业，1998,24(5).64 腐菌， [4]Michrael G.Gold M H.Molecular biology of thre lignin-degrad- (2)采样的原水为河南省淇县造纸厂造纸废 ing basidiomycete Phranerochraete chrrysosporium.Microbiol 水，驯化用污泥为高碑店污水处理厂二沉池回流污 Rew,1993,57(3):605 泥，待原水比例提至100%降解2d后出水C0Dc,去 [5]Glenn J K.Gold M H.Decolorization of several polymeric dyes by 除率达到74%. the lignin-degrading basidiomycete Phranerochroete chrrysospori- m.Appl Environ Microbiol,1983.45:1741 (③)采用稀释倒平板法从驯化后的污泥中分离 [6]Crawford R L.Liglin Biodegration and Transformation.New 出三种菌，经平板划线法纯化得到三种纯菌，通过 York:John Wiley &Sons Inc.1981:42 白腐菌的特征反应一Bavendamm反应一证实 [7]孙先锋，张志杰，崔红军·造纸黑液木质素降解微生物的分离 菌落为白腐菌，对白腐菌进行革兰氏染色实验，判 和降解特性研究，环境工程，2002,20(3)：78 [8]林刚，文湘华，钱易，应用白腐真菌技术处理难降解有机物的 定该菌种为革兰氏阳性菌，菌种形态为短杆状，菌 研究进展.环境污染治理技术与设备，2001,2(4)：1 种生长周期为70h,并初步判定其为好氧型的产 [9]钱存柔，黄仪秀微生物学实验教程.北京：北京大学出版社， 碱菌， 1999,58 (4)在原水比例70%、pH初始值为5以及初始 [10]钱大益，朱益丹，宋存义，等.光合细菌的生长条件.北京科 溶解氧浓度为4mgL条件下，最终CODc去除率 技大学学报，2005,27(2)：156 为80.9%. Screening and identification of strain degrading lignin and its application in paper- making wastew ater treatment LIN Hai,LU Gang,ZHA NG Qingna,LV Lvzhou,JIA Xiuming Civil and Environmental Engineering School,University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083.China ABSTRACI To improve the biological treatment effect of paper making wastewater,the screening and identi- fication of strain degrading lignin and its application were carried out.The strain able to degrading lignin was obtained after a series of experiments including sampling,domesticating,separating and identifying etc,and it was defined as a white rot fungi,short rod,aerobic alkali producing bacteria based on investigations on its phys- iological and biochemical prosperities.After Gram s stain,the strain was identified as a Gram positive bacteri- um.In further research,the strain strongly capable of degrading was selected to apply in wastewater treatment experiment and the results showed that this bacterium possessed a removal rate of 80.9for CODCr in wastew- ater from paper mills,which displayed good prospects of application. KEY WORDS wastew ater treatment;paper making wastewater;lignin;white-rot fungi;screening;domesti- cation
长所需足够的氧大大提高了其适应环境的能力在 培养初期即表现出良好的降解效果． 3 结论 （1） 通过采样、驯化、分离和鉴定等一系列实 验培养出能够降解木质素的生物降解菌－－－白 腐菌． （2） 采样的原水为河南省淇县造纸厂造纸废 水驯化用污泥为高碑店污水处理厂二沉池回流污 泥待原水比例提至100％降解2d 后出水 CODCr去 除率达到74％． （3） 采用稀释倒平板法从驯化后的污泥中分离 出三种菌经平板划线法纯化得到三种纯菌．通过 白腐菌的特征反应－－－Bavendamm 反应－－－证实 菌落为白腐菌．对白腐菌进行革兰氏染色实验判 定该菌种为革兰氏阳性菌菌种形态为短杆状．菌 种生长周期为70h并初步判定其为好氧型的产 碱菌． （4） 在原水比例70％、pH 初始值为5以及初始 溶解氧浓度为4mg·L －1条件下最终 CODCr去除率 为80∙9％． 参 考 文 献 ［1］ 庾晋周洁．我国造纸业发展现状和趋势．黑龙江造纸2001 4：10 ［2］ 林云琴周少奇．白腐菌降解纤维素和木质素的研究进展．环 境技术20034：29 ［3］ 韦朝海任源．淮河流域酿造业生产与环境污染的损益分析． 食品与发酵工业199824（5）：64 ［4］ Michrael GGold M H．Molecular biology of thre lignin-degrading basidiomycete Phranerochraete chrrysosporium． Microbiol Rev199357（3）：605 ［5］ Glenn J KGold M H．Decolorization of several polymeric dyes by the lignin-degrading basidiomycete Phranerochraete chrrysosporium．Appl Environ Microbiol198345：1741 ［6］ Crawford R L．Liglin Biodegration and Transformation．New York：John Wiley ＆ Sons Inc1981：42 ［7］ 孙先锋张志杰崔红军．造纸黑液木质素降解微生物的分离 和降解特性研究．环境工程200220（3）：78 ［8］ 林刚文湘华钱易．应用白腐真菌技术处理难降解有机物的 研究进展．环境污染治理技术与设备20012（4）：1 ［9］ 钱存柔黄仪秀．微生物学实验教程．北京：北京大学出版社 1999：58 ［10］ 钱大益朱益丹宋存义等．光合细菌的生长条件．北京科 技大学学报200527（2）：156 Screening and identification of strain degrading lignin and its application in papermaking wastewater treatment LIN HaiLU GangZHA NG QingnaLV Lvz houJIA Xiuming Civil and Environmental Engineering SchoolUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China ABSTRACT To improve the biological treatment effect of paper-making wastewaterthe screening and identification of strain degrading lignin and its application were carried out．The strain able to degrading lignin was obtained after a series of experiments including samplingdomesticatingseparating and identifying etcand it was defined as a white-rot fungishort-rodaerobic alkal-i producing bacteria based on investigations on its physiological and biochemical prosperities．After Gram’s stainthe strain was identified as a Gram-positive bacterium．In further researchthe strain strongly capable of degrading was selected to apply in wastewater treatment experiment and the results showed that this bacterium possessed a removal rate of80∙9％ for CODCr in wastewater from paper millswhich displayed good prospects of application． KEY WORDS wastewater treatment；paper-making wastewater；lignin；white-rot fungi；screening；domestication 第6期 林 海等： 降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用 ·573·