重组DNA技术 Recombinant DNA Technology 刘新文 nd 北京大学医学部生物化学与分子生物学系
重组DNA技术 刘新文 北京大学医学部生物化学与分子生物学系
刘新文，重组DNA技术 第一节概述 超 ■DNA克隆(DNA cloning):应用酶学的方法，在 体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子一复制子，继而通过转化或转 染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞， 再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。 DNA克隆又称基因克隆(gene cloning) I基因工程(genetic engineering):实现基因克 隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技 术（recombinant DNA technology）
刘新文，重组DNA技术 第一节 概述 DNA克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在 体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转 染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞， 再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。 DNA克隆又称基因克隆（gene cloning）。 基因工程（genetic engineering）：实现基因克 隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技 术（recombinant DNA technology）
刘新文， 重组DNA技术 一、】 克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿 主细胞等 l、目的基因(target gene):cDNA或基因组DNA >CDNA (complementary DNA):指体外经反转录 合成的，与RNA(常指mRNA)互补的单链DNA, 单链cDNA进而合成双链cDNA。 >基因组DNA(genomic DNA)：代表一个细胞或生 物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组 DNA。 2、载体(vector):质粒、 噬菌体、柯斯质粒载体、 病毒和人工染色体等
刘新文，重组DNA技术 一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿 主细胞等 1、目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA 2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、 病毒和人工染色体等 cDNA （complementary DNA）：指体外经反转录 合成的，与RNA （常指mRNA）互补的单链DNA, 单链cDNA进而合成双链cDNA。 基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生 物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组 DNA
刘新文，重组DNA技术 >质粒(plasmid)：存在于细菌染色体外的小型环 状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在 细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚 合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA 酶、DNA酶，等 3.1限制性核酸内切酶restriction endonuclease):存在 于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核 苷酸序列的一类核酸酶。 >常用的是II类限制性内切酶 >许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构
刘新文，重组DNA技术 质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环 状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在 细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在 于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核 苷酸序列的一类核酸酶。 3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚 合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA 酶、DNA酶，等 常用的是II类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构
刘新文，重组DNA技术 >配伍末端(compatible end):不同限制性内切酶产 生的相同粘性末端 3.2DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶) Klenow/片段(KIenow酶)、T4DNA聚合酶以及Taq酶等 3.3DNA连接酶 >T4连接酶：可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞
刘新文，重组DNA技术 配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产 生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、 Klenow片段 (Klenow 酶)、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等 3.3 DNA连接酶 T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞