皮碱、异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱时均可利用它们的沸点不同进行常压或减压分馏，然后再精制纯化，达到分离的目的。四、吸附法吸附法的目的，一种是吸附除去杂质，这常指质、色素：另一种是吸附所需物质。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、氧化镁、白陶土和活性炭等。如京尼平苷的分离，取栀子粉，用乙醇提取，提取物的水溶液加氧化镁吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩得黄色固体粉末，再经乙酸乙酯/丙酮（1：1）重结晶即得到京尼平苷的纯品。五、沉淀法利用某些中药成分与某些试剂产生沉淀的性质而达到分离或除去“杂质”的方法。但对所需成分来讲，这种沉淀反应是可逆性的。最常用的是铅盐法，利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐沉淀，故可利用这种性质使所需成分与杂质分离，脱铅方法常通以硫化氢气体，使其分解并转为不溶性硫化铅沉淀而除去。但溶液中可能有多余的硫化氢存在，可通入空气或二氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体。若对热稳定的化合物，可将溶液置于蒸发血内，水浴上加热，浓缩除去。脱铅的方法也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等，但生成的硫酸铅及磷酸铅在水中有一定的溶解度，所以脱铅不彻底。但方法比较简便，故实验室中仍常采用。此外，还有乙酸钾、氢氧化锁、磷钨酸、硅钨酸等沉淀剂。对多糖、蛋白质等常用丙酮、乙醇或乙醚沉淀。六、盐析法盐析法通常是向中药水提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或达到饱和状态，使某些成分在水中的溶解度降低，沉淀析出或被有机溶剂提取出。常用的无机盐有氯化钠、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁等。如三颗针粗粉用稀酸浸泡，稀酸液加氯化钠至饱和即析出小檗碱盐酸盐。七、透析法利用小分子物质在溶液中可透过半透膜，而大分子不能透过半透膜的性质，利用不同规格的透析膜除去大分子物质如蛋白质、多肽、多糖中夹杂的小分子杂质，而达到分离的方法。常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。透析法可除去其中无机盐、单糖、双糖等。透析是否成功与膜孔的大小密切相关，根据欲分离成分分子的大小选择适当规格的透析膜。常用的有动物膜（如猪、牛的膀胱），火棉胶膜、蛋白质胶膜和玻璃纸膜等。在进行透析时应经常更换膜外清水，增加透析膜内外溶液的浓度差，必要时可适当加温并加以搅拌，以加快透析速度，也可用电透析法。八、升华法-9-
- 9 - 皮碱、异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱时均可利用它们的沸点不同进行常压或减压分馏，然后再精 制纯化，达到分离的目的。 四、吸附法 吸附法的目的，一种是吸附除去杂质，这常指鞣质、色素；另一种是吸附所需物质。常用的 吸附剂有硅胶、氧化铝、氧化镁、白陶土和活性炭等。如京尼平苷的分离，取栀子粉，用乙醇提 取，提取物的水溶液加氧化镁吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩得黄色固体粉末，再经乙 酸乙酯／丙酮（1:1）重结晶即得到京尼平苷的纯品。 五、沉淀法 利用某些中药成分与某些试剂产生沉淀的性质而达到分离或除去“杂质”的方法。但对所需 成分来讲，这种沉淀反应是可逆性的。最常用的是铅盐法，利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或 稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐沉淀，故可利用这种性质使所需成分与杂质分离，脱 铅方法常通以硫化氢气体，使其分解并转为不溶性硫化铅沉淀而除去。但溶液中可能有多余的硫 化氢存在，可通入空气或二氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体。若对热稳定的化合物，可将溶 液置于蒸发皿内，水浴上加热，浓缩除去。脱铅的方法也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等， 但生成的硫酸铅及磷酸铅在水中有一定的溶解度，所以脱铅不彻底。但方法比较简便，故实验室 中仍常采用。此外，还有乙酸钾、氢氧化钡、磷钨酸、硅钨酸等沉淀剂。对多糖、蛋白质等常用 丙酮、乙醇或乙醚沉淀。 六、盐析法 盐析法通常是向中药水提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或达到饱和状态，使某些成分 在水中的溶解度降低，沉淀析出或被有机溶剂提取出。常用的无机盐有氯化钠、氯化铵、硫酸 铵、硫酸钠、硫酸镁等。如三颗针粗粉用稀酸浸泡，稀酸液加氯化钠至饱和即析出小檗碱盐酸 盐。 七、透析法 利用小分子物质在溶液中可透过半透膜，而大分子不能透过半透膜的性质，利用不同规格的 透析膜除去大分子物质如蛋白质、多肽、多糖中夹杂的小分子杂质，而达到分离的方法。常用于 纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。透析法可除去其中无机盐、单糖、双糖等。透析是否 成功与膜孔的大小密切相关，根据欲分离成分分子的大小选择适当规格的透析膜。常用的有动物 膜（如猪、牛的膀胱），火棉胶膜、蛋白质胶膜和玻璃纸膜等。在进行透析时应经常更换膜外清 水，增加透析膜内外溶液的浓度差，必要时可适当加温并加以搅拌，以加快透析速度，也可用电 透析法。 八、升华法
具有相当高蒸气压的某些固体物质当加热至一定温度时，不经过液体而直接气化，遇冷文凝结成原来的固体，此现象称为升华。中药中凡具有升华性质的化合物，均可用此法进行纯化。例如樟木中的樟脑，茶叶中的咖啡因以及中药中的苯甲酸等成分。升华法简单易行，但往往不完全，常伴有分解现象，产率低，操作时采用减压下加热开华的方法则可避免，但该法很少用手大规模制备（装置见图1-5）。图1-5几种简单的升华装置图第二节结晶和重结晶结晶的目的在于进一步分离纯化，便于进行化学鉴定及结构测定工作。中药成分大半是固体化合物，且具有结晶的通性，可以根据其在某种溶剂或混合溶剂中溶解度的不同用结晶法达到分离精制的目的。一般能结晶的化合物可望得到单纯晶体，纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学特征，这有利于化合物性质的判断，所以结晶是研究分子结构的重要步骤。由于初析出的结晶多少总会带有一些杂质，因此需要通过反复结晶才能得到纯粹的单一晶体，此步骤称为复结晶或重结晶。有时中药中某一成分含量特别高，找到合适的溶剂进行提取，提取液冷却或稍浓缩，便可得到结晶。一、结晶的条件需要结晶的溶液，往往呈过饱和状态。通常是在加热的情况下，使化合物溶解，过滤除去不溶性杂质，然后浓缩、放冷，析晶。最合适的结晶温度为510℃左右。如果在室温条件下可以析晶，就不需要放入冰箱中。放置对形成结晶来说是一个重要条件，它可使溶剂自然挥发到适当的浓度，即可析出结晶。特别是在探索过程中，对未知成分的结晶浓度是很难预测的，有时溶液太浓，粘度大就不易结晶；如果浓度适中，逐渐降温，可能析出纯度较高的结晶。X一射线衍射用的单晶即采用此法。在结晶过程中溶液浓度高则析出结晶的速度快，颗粒较小，夹杂的杂质可-10-
- 10 - 具有相当高蒸气压的某些固体物质当加热至一定温度时，不经过液体而直接气化，遇冷又凝 结成原来的固体，此现象称为升华。中药中凡具有升华性质的化合物，均可用此法进行纯化。例 如樟木中的樟脑，茶叶中的咖啡因以及中药中的苯甲酸等成分。升华法简单易行，但往往不完 全，常伴有分解现象，产率低，操作时采用减压下加热升华的方法则可避免，但该法很少用于大 规模制备（装置见图1-5）。 图1-5 几种简单的升华装置图 第二节 结晶和重结晶 结晶的目的在于进一步分离纯化，便于进行化学鉴定及结构测定工作。中药成分大半是固体 化合物，且具有结晶的通性，可以根据其在某种溶剂或混合溶剂中溶解度的不同用结晶法达到分 离精制的目的。一般能结晶的化合物可望得到单纯晶体，纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学 特征，这有利于化合物性质的判断，所以结晶是研究分子结构的重要步骤。由于初析出的结晶多 少总会带有一些杂质，因此需要通过反复结晶才能得到纯粹的单一晶体，此步骤称为复结晶或重 结晶。有时中药中某一成分含量特别高，找到合适的溶剂进行提取，提取液冷却或稍浓缩，便可 得到结晶。 一、结晶的条件 需要结晶的溶液，往往呈过饱和状态。通常是在加热的情况下，使化合物溶解，过滤除去不 溶性杂质，然后浓缩、放冷，析晶。最合适的结晶温度为5～10℃左右。如果在室温条件下可以 析晶，就不需要放入冰箱中。放置对形成结晶来说是一个重要条件，它可使溶剂自然挥发到适当 的浓度，即可析出结晶。特别是在探索过程中，对未知成分的结晶浓度是很难预测的，有时溶液 太浓，粘度大就不易结晶；如果浓度适中，逐渐降温，可能析出纯度较高的结晶。X－射线衍射 用的单晶即采用此法。在结晶过程中溶液浓度高则析出结晶的速度快，颗粒较小，夹杂的杂质可
能多些。有时自溶液中析出结晶的速度太快，超过化合物晶核的形成和分子定向排列的速度，往往只能得到无定形粉末。二、结晶溶剂的选择选择合适的溶剂是形成结晶的关键。合适的溶剂对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差异，即热时溶解，冷时则析出，同时不与要提纯的成分产生化学反应。对杂质来说，在该溶剂中应不溶或难溶。亦可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶，则可用洗涤法除去杂质后再用合适溶剂结晶。要找到合适的溶剂，一方面可查阅有关资料及参阅同类型化合物的结晶条件：另一方面也可进行少量探索，参考“相似相溶原理”加以考虑。常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等。不能选择适当的单一溶剂时可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂，要求低沸点溶剂对物质的溶解度大、高沸点溶剂对物质的溶解度小，这样在放置时，沸点低的溶剂较易挥发，比例逐渐减少易达到过饱和状态，有利于结晶的形成。选择溶剂的沸点不宜太高，要适中，以60℃～80℃左右为好，沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制：太高则不便浓缩，同时不易除去。在结晶或重结晶时要注意化合物是否和溶剂生成复合物或含有结晶溶剂的化合物。但有时也利用此性质使本来不易形成结晶的化合物得到结晶。三、制备结晶的方法结晶形成过程包括晶核的形成与晶体的增长两步骤。因此，选择适当的溶剂是形成晶核的关键。通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤、浓缩至适当体积后，塞紧瓶塞，静置，如果放置一段时间后没有结晶析出，可松动瓶塞，使溶剂自动挥发，可望得到结晶；或在结晶溶液中加入少量晶种，加晶种是诱导晶核形成的有效手段。一般地说，结晶化过程具有高度的选择性，当加入同种分子，结晶便会立即增长。如没有晶种时，可用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁，产生微小颗粒代替晶核，以诱导方式形成结晶。有时用玻璃棒蘸取过饱和液在空气中挥发除去部分溶剂后再摩擦玻璃器壁。上述条件失败后，应考虑所用物质纯度不够，可能是由于杂质的影响所致，则需进一步分离纯化，再尝试结晶，或化合物本身就是不能形成晶体的化合物，如於碱等。四、不易结晶或非晶体化合物的处理化合物不易结晶，其原因一种是本身的性质所决定，另一种在很大程度上是由于纯度不够，夹杂不纯物引起的。若是后者就需要进一步分离纯化，若是本身的性质，往往需要制备结晶性的衍生物或盐，然后用化学方法处理，回复到原来的化合物，达到分离纯化的目的。如生物碱，常通过成盐来达到纯化，常用的有盐酸盐，氢漠酸盐、氢碘酸盐、过氯酸盐和苦味酸盐等。如治疗肝炎药物的有效成分垂盆草苷，本身不能形成结晶，其乙酰化物却具有良好的针状晶体。此外，也可利用某些化合物与某种溶剂形成复合物或加成物而结晶，如穿心莲亚硫酸氢钠加成物在稀丙酮中容易结晶：蝙蝠葛碱能和氯仿或乙醚形成复合物结晶。但有些结晶性化合物在用不同溶剂结-11-
- 11 - 能多些。有时自溶液中析出结晶的速度太快，超过化合物晶核的形成和分子定向排列的速度，往 往只能得到无定形粉末。 二、结晶溶剂的选择 选择合适的溶剂是形成结晶的关键。合适的溶剂对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著 的差异，即热时溶解，冷时则析出，同时不与要提纯的成分产生化学反应。对杂质来说，在该溶 剂中应不溶或难溶。亦可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶，则可用洗涤法 除去杂质后再用合适溶剂结晶。要找到合适的溶剂，一方面可查阅有关资料及参阅同类型化合物 的结晶条件；另一方面也可进行少量探索，参考“相似相溶原理”加以考虑。常用的结晶溶剂有 甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等。不能选择适当的单一溶剂时可选用两种或两种以上溶剂组成的 混合溶剂，要求低沸点溶剂对物质的溶解度大、高沸点溶剂对物质的溶解度小，这样在放置时， 沸点低的溶剂较易挥发，比例逐渐减少易达到过饱和状态，有利于结晶的形成。选择溶剂的沸点 不宜太高，要适中，以60℃～80℃左右为好，沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制；太高则不便浓 缩，同时不易除去。在结晶或重结晶时要注意化合物是否和溶剂生成复合物或含有结晶溶剂的化 合物。但有时也利用此性质使本来不易形成结晶的化合物得到结晶。 三、制备结晶的方法 结晶形成过程包括晶核的形成与晶体的增长两步骤。因此，选择适当的溶剂是形成晶核的关 键。通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤、浓缩至适当体积后，塞紧瓶塞，静置，如果放置一段 时间后没有结晶析出，可松动瓶塞，使溶剂自动挥发，可望得到结晶；或在结晶溶液中加入少量 晶种，加晶种是诱导晶核形成的有效手段。一般地说，结晶化过程具有高度的选择性，当加入同 种分子，结晶便会立即增长。如没有晶种时，可用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁，产生微小颗粒代替 晶核，以诱导方式形成结晶。有时用玻璃棒蘸取过饱和液在空气中挥发除去部分溶剂后再摩擦玻 璃器壁。上述条件失败后，应考虑所用物质纯度不够，可能是由于杂质的影响所致，则需进一步 分离纯化，再尝试结晶，或化合物本身就是不能形成晶体的化合物，如菸碱等。 四、不易结晶或非晶体化合物的处理 化合物不易结晶，其原因一种是本身的性质所决定，另一种在很大程度上是由于纯度不够， 夹杂不纯物引起的。若是后者就需要进一步分离纯化，若是本身的性质，往往需要制备结晶性的 衍生物或盐，然后用化学方法处理，回复到原来的化合物，达到分离纯化的目的。如生物碱，常 通过成盐来达到纯化，常用的有盐酸盐，氢溴酸盐、氢碘酸盐、过氯酸盐和苦味酸盐等。如治疗 肝炎药物的有效成分垂盆草苷，本身不能形成结晶，其乙酰化物却具有良好的针状晶体。此外， 也可利用某些化合物与某种溶剂形成复合物或加成物而结晶，如穿心莲亚硫酸氢钠加成物在稀丙 酮中容易结晶；蝙蝠葛碱能和氯仿或乙醚形成复合物结晶。但有些结晶性化合物在用不同溶剂结
晶时亦可形成溶剂复合物，如汉防己乙素和丙酮形成结晶的加合物：千金藤素与苯形成加合物结晶。结晶的形状很多，常见为针状、柱状、棱柱状、板状、方晶、粒状、簇状及多边形棱柱状晶体等，结晶形状随结晶的条件不同而异。五、结晶纯度的判断每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和熔点，可以作为初步鉴定的依据，并结合薄层色谱或纸色谱，经三种以上不同展开系统展开，均显示单一斑点来判断结晶的纯度。而非结晶物质则不具备上述物理性质。纯结晶化合物都有一定的晶形和均匀的色泽，通常在同一种溶剂下结晶形状是一致的，单纯化合物晶体的熔点熔距应在0.5℃～1.0℃左右，但由于晶体结构的原因可允许在1℃~2℃内。但也有例外，特别有些化合物仅有分解点，而熔点不明显。对立体异构体和结构非常类似的混合物，如土槿皮酸从晶形、熔点、熔距来看，是纯化合物的特征，但薄层检查有三个斑点。滤纸的折叠常压过滤1布氏漏斗2抽滤瓶3缓冲瓶4接真空泵减压过滤装置热过滤装置图1-6结晶过程中几种常用装置第三节层析分离方法- 12 -
- 12 - 晶时亦可形成溶剂复合物，如汉防己乙素和丙酮形成结晶的加合物；千金藤素与苯形成加合物结 晶。结晶的形状很多，常见为针状、柱状、棱柱状、板状、方晶、粒状、簇状及多边形棱柱状晶 体等，结晶形状随结晶的条件不同而异。 五、结晶纯度的判断 每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和熔点，可以作为初步鉴定的依据，并结合薄层色 谱或纸色谱，经三种以上不同展开系统展开，均显示单一斑点来判断结晶的纯度。而非结晶物质 则不具备上述物理性质。纯结晶化合物都有一定的晶形和均匀的色泽，通常在同一种溶剂下结晶 形状是一致的，单纯化合物晶体的熔点熔距应在0.5℃～1.0℃左右，但由于晶体结构的原因可允 许在1℃~2℃内。但也有例外，特别有些化合物仅有分解点，而熔点不明显。对立体异构体和结 构非常类似的混合物，如土槿皮酸从晶形、熔点、熔距来看，是纯化合物的特征，但薄层检查有 三个斑点。 滤纸的折叠 常压过滤 热过滤装置 减压过滤装置 图1-6 结晶过程中几种常用装置 第三节 层析分离方法 4 接真空泵 3 缓冲瓶 1 布氏漏斗 2 抽滤瓶
层析法一般称色谱法，是一种分离和鉴定复杂混合物的有效方法，广泛用于天然产物有效成分的分离提纯。由于中药中的各类成分结构不同，性质各异，选择的层析法也不同。层析法的分类有两种：一种是根据两相所处的状态来划分，当液体作为流动相时称液相层析，气体作为流动相时称气相层析。另一种是根据层析过程的机理来分类，利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异来分离的称吸附层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离的称分配层析：利用分子大小不同进行分离的称排阻层析或分子筛层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离的称离子交换层析等等。需要提出的是，在层析过程中并非是单因素的作用，而是多因素的作用来达到分离目的的。下面介绍实验室中常用的一些层析方法。一、硅胶柱层析硅胶为一多孔性物质，可用通式Si02·xH20表示。它具有多孔性的硅氧环的交链结构，由于其骨架表面具有很多游离、键合的硅醇基团，它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分。当加热（100～110℃）活化30min后，硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去。但温度升至500℃时，硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧环结构而不再具有吸附的性质。硅胶层析适用范围广，适用于非极性和极性化合物，如类、留体、生物碱、强心、葱醒类、酸性、酚性化合物、磷脂类，脂肪酸、氨基酸等的分离，但不宜分离碱性物质，（一）层析柱的制备硅胶装柱一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待溶液中气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比为1:20～1:30。若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围窄，则可采用短柱（1：5），这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果。另亦可采用于法装柱，将所需硅胶一次倾入柱中，然后墩紧至硅胶高度不改变为止。欲分离样品与吸附剂的比例约为1:30～1:60（装置见图1-7）。洛剂一滤纸片图ONH固体和溶剂:HRYS脱脂棉一星- 13 -
- 13 - 层析法一般称色谱法，是一种分离和鉴定复杂混合物的有效方法，广泛用于天然产物有效成 分的分离提纯。由于中药中的各类成分结构不同，性质各异，选择的层析法也不同。层析法的分 类有两种：一种是根据两相所处的状态来划分，当液体作为流动相时称液相层析，气体作为流动 相时称气相层析。另一种是根据层析过程的机理来分类，利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的 差异来分离的称吸附层析；利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离的称分配 层析；利用分子大小不同进行分离的称排阻层析或分子筛层析；利用不同组分对离子交换剂亲和 力不同进行分离的称离子交换层析等等。需要提出的是，在层析过程中并非是单因素的作用，而 是多因素的作用来达到分离目的的。下面介绍实验室中常用的一些层析方法。 一、硅胶柱层析 硅胶为一多孔性物质，可用通式SiO2·xH2O 表示。它具有多孔性的硅氧环的交链结构，由于 其骨架表面具有很多游离、键合的硅醇基团，它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同 时能吸附多量的水分。当加热（100～110℃）活化30min后，硅胶表面因氢键所吸附的水分能可 逆地被除去。但温度升至500℃时，硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧环结构而不再 具有吸附的性质。 硅胶层析适用范围广，适用于非极性和极性化合物，如萜类、甾体、生物碱、强心苷、蒽醌 类、酸性、酚性化合物、磷脂类，脂肪酸、氨基酸等的分离，但不宜分离碱性物质。 （一）层析柱的制备 硅胶装柱一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待溶液中气泡除去后，连同 溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比为1:20～1:30。若硅胶的颗粒较细，而 粒度分布范围窄，则可采用短柱（1:5），这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。 硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象， 影响分离效果。另亦可采用干法装柱，将所需硅胶一次倾入柱中，然后墩紧至硅胶高度不改变为 止。欲分离样品与吸附剂的比例约为1:30～1:60（装置见图1-7）