2.酶法一一双脱氧终止法,自动测序的原理 双脱氧链终止法 DNA的合成总是从5°端向3'端进行的。DNA的合成需要模板以及相应 的引导核酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3末端,依据碱 基配对的原则,通过生成新的3,5一磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产 生短的DNA链。具体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相 同的模板,相同的引物以及四种脱氧核苷酸;并在四组反应中各加入适量 的四种之一的双脱氧核苷酸,使其随机地接入DNA链中,使链合成终止, 产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开,经过放射自显影显示区带, 就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列 Primer HCTAAGCTCGACT dCTP, dGTP, dATP, dTTP ddATP ddcTp ddGTP t ddTTP -ATTCGAGCTGILA TTCGAGCTddG -GATTCGAGCIIT HlA tCDd - GAdd G 3AGTcGAGcTTAG Autoradiogram of electropboresis gel 目前根据该原理能够实现对DNA的自动测序。 3.DNA化学降解法 Maxam和 Gilbert(1977):基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记 通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定
2.酶法——双脱氧终止法，自动测序的原理 Sanger 双脱氧链终止法： DNA 的合成总是从 5’端向 3’端进行的。DNA 的合成需要模板以及相应 的引导核酸链。DNA 的合成过程中，在合成的 DNA 链的 3’末端，依据碱 基配对的原则，通过生成新的 3’,5’－磷酸二酯键，使 DNA 链合成终止，产 生短的 DNA 链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相 同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量 的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入 DNA 链中，使链合成终止， 产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的 DNA 链。这四组 DNA 链再 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带， 就可以直接读出被测 DNA 的核苷酸序列。 目前根据该原理能够实现对 DNA 的自动测序。 3. DNA 化学降解法 Maxam 和 Gilbert（1977）：基本步骤为(1)先将 DNA 的末端之一进行标记 (通常为放射性同位素 32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定
碱基的化学修饰;(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;(4)聚丙烯酰胺 凝胶电泳将DNA链按长短分开;(5)根据放射自显影显示区带,直接读出 DNA的核苷酸序列。 第三节DNA的二级结构 、DNA的二级结构双螺旋结构模型( double heliⅸ model) 1953年, Watson和 Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型, 揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中,以及遗传性状何以在世代间得 以保持。 50年代初, Changan应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术,对 多种生物DNA作碱基定量分析,发现DNA碱基组成有如下规律 (1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同 (2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化 而改变 (3)几乎所有的DNA,无论种属来源如何,其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧 啶摩尔含量相同([A]=[T),鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(〖G] [C]),总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同([A+G]=[C]+[T)。 同,(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同,表现在A+TG+C比值的不 这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证 Watson和 Crick以立体化学原理为准则,对 Wilkins和 Franklin的DNA ⅹ射线衍射分析结果加以研究,提出了DNA结构的双螺旋模式(如下图), 其主要内容如下: Minor groove Major 36A
碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开 DNA 链；(4)聚丙烯酰胺 凝胶电泳将 DNA 链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出 DNA 的核苷酸序列。 第三节 DNA 的二级结构 一、DNA 的二级结构 双螺旋结构模型(double helix model) 1953 年，Watson 和 Crick 提出了著名的 DNA 分子的双螺旋结构模型， 揭示了遗传信息是如何储存在 DNA 分子中，以及遗传性状何以在世代间得 以保持。 50 年代初，Chargaff 应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对 多种生物 DNA 作碱基定量分析，发现 DNA 碱基组成有如下规律： (1)同一生物的不同组织的 DNA 碱基组成相同； (2)一种生物 DNA 碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化 而改变； (3)几乎所有的 DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧 啶摩尔含量相同([A］=［T])，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同([G］ =［C])，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(［A＋G］=［C]＋［T])。 (4)不同生物来源的 DNA 碱基组成不同，表现在 A＋T/G＋C 比值的不 同； 这些结果后来为 DNA 的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。 Watson 和 Crick 以立体化学原理为准则，对 Wilkins 和 Franklin 的 DNA X 射线衍射分析结果加以研究，提出了 DNA 结构的双螺旋模式（如下图）， 其主要内容如下：