鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大,需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
鸟枪法克隆目的基因的局限性 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
5目的基因的克隆与基因文库的构建 B CDNA法 CDNA法克隆目的基因的基本战略 CDNA法分离目的基因的基本程序 CDNA法法克隆目的基因的局限性
B cDNA B cDNA法 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 cDNAN法克隆目的基因的基本战略 法克隆目的基因的基本战略 cDNAN法分离目的基因的基本程序 法分离目的基因的基本程序 cDNA cDNA法法克隆目的基因的局限性 法法克隆目的基因的局限性
CDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第一链的合成 mdNA G ppp 5 G AAAAAAAAAAAAAAoh 3 引物退火 G 5ppp5 G AAAAAAAAAAAAAAoh 3 乎中r乎TTTp 逆转录酶 dNTPs G 5ppp5G AAAAAAAAAAAAAAoh 3 p 5 cDNA第一链
cDNA法克隆目的基因的基本战略 法克隆目的基因的基本战略 mDNA mDNA cDNA第一链的合成 G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAOHOH 3’ 3’ G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAOHOH 3’ 3’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAOHOH 3’ 3’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ cDNA cDNA第一链 第一链 引物引物 退火退火 逆转录酶 逆转录酶 dNTPs dNTPs
cDNA第二链的合成 自身引导法:获得的双链cDNA5端会有几对碱基缺失 G5ppp5GAAAAAAAAAAAAAAOH3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 Naoh 煮沸 TTTTTTTTTTTTTTp 5 画OH3 Klenow dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAoh 3 S1 PTTTTTpTTTTT乎T AAAAAAAAAAAAAA
ccDNA DNA第二链的合成 第二链的合成 NaOH NaOH 煮沸煮沸 自身引导法： 自身引导法：获得的双链 获得的双链cDNA 5’ cDNA 5’端会有几对碱基缺失 端会有几对碱基缺失 AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAOHOH 3’ 3’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAOHOH 3’ 3’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTT OHOH 3’ 3’ Klenow Klenow dNTPs dNTPs S1S1
cDNA第二链的合成 置换合成法:获得的双链cDNA5'端也会有几对碱基缺失 G ppp 5 G AAAAAAAAAAAAAAoh 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 RNaesH DNApol dNTPs aAaattToH 3 中中乎中中乎TTp TTTTTTTTTTTTTTOH 3 AAAAAAAAAAAAAAp 5 S1 T4- DNA gase TTTTTTTTTTTTTT 3 AAAAAAAAAAAAAA 5
ccDNA DNA第二链的合成 第二链的合成 RNaesH RNaesH DNApol dNTPs DNApol dNTPs 置换合成法： 置换合成法：获得的双链 获得的双链cDNA 5’ cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 端也会有几对碱基缺失 G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAOHOH 3’ 3’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAApp 5’ 5’ 5’ 5’ S1S1 AAAA AAAATTT TTTOHOH 3’ 3’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTpp 5’ 5’ 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTOHOH 3’ 3’ AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ 3’ 3’ T4-DNA ligase T4-DNA ligase